甜菜孢囊線蟲（Heterodera schachtii）是全世界重要的檢疫性有害生物，對(duì)甜菜具有毀滅性危害。1850 年德國(guó)首次報(bào)道該線蟲(Franklin ＆ Heterodera, 1972) 。到目前為止，該線蟲已在全世界的美洲、歐洲、亞洲等50多個(gè)國(guó)家或地區(qū)有分布，20多個(gè)國(guó)家將該線蟲列為檢疫對(duì)象(Steele, 1984) 。甜菜孢囊線蟲是甜菜上危害最嚴(yán)重的病原生物之一，可導(dǎo)致甜菜產(chǎn)量損失25%～50%，每年造成超過(guò)150億美元的經(jīng)濟(jì)損失 (Singh et al., 2015)。篩選土壤樣本以定性和定量地評(píng)估線蟲感染是一項(xiàng)預(yù)防措施，也是農(nóng)業(yè)害蟲管理策略的一個(gè)組成部分。
甜菜孢囊線蟲以卵的形式在土壤中可以存活多年，孢囊是由雌性線蟲的遺骸形成的保護(hù)性外殼。雌性線蟲死亡后，其體壁變硬，形成棕色的硬化孢囊。量化線蟲感染的能力是針對(duì)線蟲的控制措施以及開發(fā)抗線蟲植物育種系的先決條件。可以通過(guò)孢囊計(jì)數(shù)來(lái)估計(jì)線蟲種群密度。孢囊需要從含有有機(jī)碎片的土壤樣品中手工挑選，其中碎片的數(shù)量取決于樣品提取方法。手動(dòng)計(jì)數(shù)是一項(xiàng)耗時(shí)的任務(wù)，計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性受到主觀決策、持續(xù)專注的能力以及將孢囊與其他顆粒分離的經(jīng)驗(yàn)的影響。因此，只有自動(dòng)計(jì)數(shù)才適用于高通量應(yīng)用。雖然線蟲的數(shù)量是一項(xiàng)重要的定量衡量標(biāo)準(zhǔn)，但表型特征（例如孢囊的大小、形狀和顏色）也是相關(guān)的。研究顯示，孢囊大小的增加是馬鈴薯孢囊線蟲種群適應(yīng)植物抗性的指標(biāo)（Fournet et al., 2016），這表明孢囊表型與抗性相關(guān)。雖然其他數(shù)據(jù)模式，例如遺傳數(shù)據(jù)，也可以應(yīng)用于估計(jì)線蟲感染（Bogale et al., 2020），但只有圖像數(shù)據(jù)可用于表征孢囊的表型。
本文介紹了一種基于計(jì)算機(jī)視覺的高通量系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以量化甜菜孢囊線蟲感染并測(cè)量孢囊的表型特征。在標(biāo)準(zhǔn)化環(huán)境中記錄土壤樣本提取物的顯微圖像后，實(shí)例分割算法用于檢測(cè)這些圖像中的線蟲孢囊。在一項(xiàng)使用已知孢囊數(shù)量的真實(shí)樣本和人工注釋圖像的評(píng)估中，計(jì)算機(jī)視覺方法產(chǎn)生了準(zhǔn)確的線蟲孢囊計(jì)數(shù)以及準(zhǔn)確的孢囊分割?；谶@樣的分割，可以計(jì)算出孢囊特征，以揭示不同土壤中線蟲種群之間的表型差異，以及甜菜種植前后觀察到的種群。計(jì)算機(jī)視覺方法不僅能夠快速準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)孢囊，而且能夠在不同條件下對(duì)孢囊特征進(jìn)行表型分析，為農(nóng)業(yè)和植物育種研究中的高通量應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。源代碼和帶注釋的圖像數(shù)據(jù)集可供科學(xué)使用，通過(guò)額外的訓(xùn)練數(shù)據(jù)，該系統(tǒng)也可以推廣到其他線蟲種類。
土壤樣本取自已知具有甜菜孢囊線蟲感染歷史的土地。通過(guò)網(wǎng)篩組合（2 mm和100 μm）制備用于圖像采集的土壤提取物。隨后，通過(guò)離心浮選技術(shù)從篩選的土壤提取物中提取孢囊。將孢囊與剩余的有機(jī)物部分一起收集在白色濾紙上，以備成像使用。樣品圖像由德國(guó)LemnaTec提供的PhenoAIxpert HM記錄（圖S1）。它由一個(gè)工業(yè)RGB相機(jī)和高倍物鏡系統(tǒng)組成。該系統(tǒng)安裝在物體上方 35 cm處，視野為 35 × 25 mm。圍繞樣品臺(tái)布置的水平定向LED（4000 K）作為照明光源。所有組件都安裝在不透明的機(jī)柜內(nèi)，以保護(hù)它們免受外部光線的影響。在PhenoAIxpert HM原型機(jī)中，樣品臺(tái)由一個(gè)樣品架組成，該樣品架可以手動(dòng)移動(dòng)到預(yù)定義的位置，以便執(zhí)行樣品的一系列成像。圖像采集由控制計(jì)算機(jī)手動(dòng)觸發(fā)。將來(lái)，樣品臺(tái)將被電動(dòng)X-Y工作臺(tái)取代，然后自動(dòng)將樣品移動(dòng)到預(yù)定義位置并以同步方式觸發(fā)圖像采集。
圖S1 PhenoAIxpert HM將由德國(guó)LemnaTec作為商業(yè)產(chǎn)品推出（HM：High Magnification）
圖1 用于線蟲孢囊分割的計(jì)算機(jī)視覺流程
表1 用于孢囊計(jì)數(shù)驗(yàn)證的樣本
圖2 手動(dòng)孢囊計(jì)數(shù)與自動(dòng)孢囊計(jì)數(shù)的比較
在所有土壤樣本類型中，手動(dòng)孢囊計(jì)數(shù)與自動(dòng)孢囊計(jì)數(shù)相似（圖2A），無(wú)論孢囊與有機(jī)碎片混合（“碎屑”）還是孢囊與有機(jī)碎片分離（“干凈”）。手動(dòng)計(jì)數(shù)和自動(dòng)計(jì)數(shù)相關(guān)性的皮爾遜相關(guān)系數(shù)很高，“干凈”為0.981，“碎屑”為0.975（圖2B），表明使用自動(dòng)方法可以可靠地估計(jì)孢囊的相對(duì)數(shù)量。
圖3 手動(dòng)孢囊分割與自動(dòng)孢囊分割的比較
圖4 線蟲孢囊表型特征的分布（孢囊大小和長(zhǎng)寬比）
—— 原文 ——
Chen L, Daub M, Luigs HG, et al. High-throughput phenotyping of nematode cysts. Frontiers in Plant Science, 2022, 13: 965254.
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