眾所周知，人類設計除草劑是為了殺死雜草，而在除草劑被反復使用的過程中自發(fā)的雜草除草劑抗性突變有巨大的選擇優(yōu)勢，并往往會迅速主導雜草種群。導致雜草快速適應并表現抗性的兩種主要機制是非靶點抗性(NTSR)和靶點抗性(TSR)。NTSR是指降解或物理上阻止活性成分達到其目標的過程，NTSR通常涉及多個基因，抗性通常是定量的。TSR具有更多的定性效應，例如對高水平除草劑的抗性為特征，并且可以追溯到改變除草劑靶標酶中單個氨基酸的大效應基因突變。雖然這對農民來說是個麻煩，但也為詳細研究生物體如何快速響應強烈的選擇提供了機會，尤其是新產生的突變和群體中已存在的突變都起到什么樣的作用，哪個更重要？
近日，德國霍恩海姆大學、馬普生物所、根特大學、美國賓夕法尼亞大學、奧地利科學院、弗雷德里?！っ仔獱枌嶒炇乙约鞍退狗蚬镜穆?lián)合研究團隊在《PNAS》在線發(fā)表了題為“Standing genetic variation fuels rapid evolution of herbicide resistance in blackgrass”的研究論文，介紹了研究團隊通過組裝大穗看麥娘( Alopecurus myosuroides )高質量參考基因組、分析已知抗除草劑等位基因變異以前向時間算法模擬發(fā)現TSR可能主要是由群體中已存在遺傳變異引起的，而新的突變只起次要作用，此外TSR的出現很可能早于除草劑的應用。這對于雜草防治和除草劑的可持續(xù)利用具有積極的指導意義。
為了進行基因組測序和組裝，研究團隊從一個來源于德國的除草劑敏感群體（Appels Wilde Samen GmbH, Darmstadt）中選擇了一個未攜帶已知ACCase、ALS或葉綠體psbA位點TSR突變的單株作為參考。前人通過福爾根光度法估計大穗看麥娘（A. myosuroides）基因組大小范圍為4.2 Gb到4.7 Gb。為了更準確地估計所選單株的基因組大小，研究團隊用黑麥（Secale cereale）作為參考標準，進行了流式細胞測量，估量單倍體基因組大小為3.56 Gb（圖1A）。通過獲得約90倍的基因組覆蓋率的PacBio連續(xù)長片段（CLRs）、約44倍基因組覆蓋率的Illumina PCR-free短讀長以及約66倍基因組覆蓋率的Hi-C染色質接觸數據，研究團隊用FALCON-Unzip的方法從頭組裝了大穗看麥娘的基因組，最終組裝大小為3.53 Gb，由七個Super-scaffolds組成（圖1B）。
組裝的大穗看麥娘的基因組與其他雜草類相比，其染色體水平的線性關系很高，其中線性關系最高的是青稞（Hordeum vulgare）（圖1C）。大穗看麥娘基因組的第2、3、4、5和7號染色體分別與青稞基因組第3、2、6、1和5號染色體有接近1：1的同義替換關系（圖1D）。一個例外是大穗看麥娘基因組的1號染色體（807 Mb）包含了與青稞基因組第4、5和7號染色體呈線性關系的片段。
新組裝的大穗看麥娘參考基因組使得評估歐洲范圍內大穗看麥娘基因組的遺傳多樣性變得容易。研究團隊對1123個大穗看麥娘單株進行了ddRAD-Seq測序，這些單株全部來源于田間疑似抗除草劑的個體，代表了來源于9個歐洲國家的44個種群，每個種群有22-24個單株。為了進行比較，研究團隊還加入了三個除草劑敏感的參考種群（圖2）。該實驗平均測序深度為22.6倍，研究團隊共鑒定到109924個單核苷酸多態(tài)性（SNPs）。最大似然法（ML）進化樹分析顯示，并未發(fā)現每個國家明確的系統(tǒng)進化情況（圖2A）。
種群之間的總體遺傳變異很低（FST范圍：0.01至0.05，n = 47；圖 2C），這與其他大穗看麥娘及其他野生雜草的研究類似。種群內個體的相關度很高（FIS=0.1；范圍0.06至0.12）。在混合分析中，研究團隊鑒別出7到9個祖先群（圖2D），這與主成分分析（PCA）的聚類結果一致（圖2B、D）。來自比利時（BE）、英國（UK）、盧森堡（LX）和法國（FR）的單株在遺傳上非常相似并聚集在一起。來自荷蘭（NL）的一個種群NL11330其他種群差異最大，FST值高達0.05（圖2C）。來源德國（DE）的單株被分為三個亞群，其中一個亞群與瑞士（CH）的個體有共同的祖先，另一個與奧地利（AT）的個體有共同的祖先，第三個亞群是高度混雜的。波蘭（PL）的種群與荷蘭的NL0166種群有共同的祖先。綜上，整個歐洲范圍內存在清晰的大穗看麥娘地理群體結構，盡管目前的數據無法推斷大穗看麥娘地理遷移的軌跡。
大部分關于除草劑耐藥性分子機制的研究都集中于除草劑抑制酶基因的突變上，主要是ALS和ACCase編碼基因，二者均可被一系列結構不同的化學物質抑制。為了了解特定位點突變和整體單倍型的多樣性，研究團隊擴增和分析了所有歐洲群體個體約13.2 kb的ACCase基因和約3.6 kb的ALS基因的片段。結果顯示，最常見ACCase基因突變是Ile1781Leu，這與該替換突變的多效性相一致，該替換突變也會在沒有選擇壓力的情況下產生而增加個體的適應性（圖3 A-C）。TSR突變通常以顯性方式作用，71.4%的ACCase基因TSR突變以雜合子的形式出現。
ACCase基因單倍型的PCA分析可將所有個體分為三個主要群體。為了更好地描述ACCase單倍型的多樣性，研究團隊進行了單倍型進化樹和關系網分析（圖3），結果顯示，不同復雜性的單倍型網絡 (圖3 A-C）可能反映了每個種群所受到的選擇壓力。在群體中，有TSR突變的27個種群中只有4個種群含有單一的TSR單倍型，且單一TSR單倍型的基因頻率很低，只有不到10%，從定義上來講上，這反映了很可能存在早期的“硬掃蕩”，但是其他23個種群中至少有兩個TSR突變的單倍型，這說明“軟掃蕩”是正常的。在其中14個種群中，研究團隊發(fā)現了來源于不同獨立突變事件的不同TSR突變單倍型，而不是同一TSR突變被通過重組轉移到其他單倍型上（圖3D）。這一觀察結果以一種無偏見的方式證實了早期探索性研究的推論。同時，研究團隊發(fā)現了從同一單倍型的單個區(qū)域產生了兩個或三個不同的TSR突變的7個單株（圖3 B、C和E）。獨立的(非重合）ACCase TSR單倍型的最大值是10。
使用除草劑的強大選擇壓力導致了雜草非?？焖俚目剐赃m應，但這有一個主要的問題：除草劑抗性主要由在使用除草劑之前群體中就已存在的遺傳變異演變而來還是使用除草劑后出現的新的突變演變而來？為了回答這個問題，研究團隊使用Hermisson & Pennings的方程，推導出適應性的概率（即通過TSR突變進化出的除草劑抗性）的期望值，以及這種適應性是由于群體中已存在遺傳變異演化而來的可能性。結果顯示，除草劑選擇發(fā)生之前的TSR變異的有害選擇系數對適應的概率只有很小的影響（圖4）；TSR突變可能主要是由群體中已存在遺傳變異引起的，而新的突變只起次要作用（圖5）。
圖4 不同場景適應性的模擬
綜上所述，研究團隊對不同情況下大穗看麥娘除草劑適應性的研究表明，隨著人類對多樣性的除草劑抗性機制的了解，很大一部分大穗看麥娘種群可能早已具備了針對目前使用除草劑的抗性和未來潛在新作用方式的適應性的的遺傳變異，這對我們發(fā)展可持續(xù)的除草劑使用策略具有重要的指導意義。
Kersten S, Chang J, Huber C D, et al. Standing genetic variation fuels rapid evolution of herbicide resistance in blackgrass[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2023, 120(16): e2206808120.
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