雜草的競爭造成的產(chǎn)量損失限制了水稻（Oryza sativa L.）的生產(chǎn)。施用化學(xué)除草劑是目前水稻生產(chǎn)中控制雜草的有效方法，特別是在現(xiàn)代簡化栽培系統(tǒng)的背景下。然而，長期大量使用除草劑，如5-烯醇丙酮酰亞胺-3-磷酸合成酶（EPSPS）、乙酰乳酸合成酶（ALS）和乙酰-CoA羧化酶（ACCase）的抑制劑，導(dǎo)致了抗除草劑雜草品種的出現(xiàn)，以及土壤中除草劑的高度殘留，這限制了作物輪作。因此，水稻生產(chǎn)上迫切需要可替代的除草劑和培育相應(yīng)抗除草劑的抗性水稻品種。
2009年以來，HPPD抑制劑類除草劑市場幾乎逐年增長，成為除草劑市場增長很快的產(chǎn)品類型之一。HPPD抑制劑類除草劑全稱是對羥基苯基丙酮酸雙氧化酶（HPPD）抑制劑，它們通過抑制HPPD的活性，使對羥基苯基丙酮酸轉(zhuǎn)化為尿黑酸的過程受阻，導(dǎo)致生育酚及質(zhì)體醌無法正常合成，進(jìn)而影響靶標(biāo)體內(nèi)類胡蘿卜素的生物合成，促使植物分生、新生組織產(chǎn)生白化癥狀，最終導(dǎo)致雜草植株死亡。大多HPPD類型的除草劑結(jié)構(gòu)上并不完全相關(guān)，但是作用效果相同。與其他除草劑相比，HPPD抑制劑的優(yōu)勢在于其廣譜性、高效力、低毒性、高的作物安全性和良好的環(huán)境兼容性。因此，HPPD抑制劑是公認(rèn)的具有優(yōu)異潛力的水稻除草劑，硝磺草酮（MST）是HPPD抑制劑類除草劑中很重要的產(chǎn)品之一，常用于玉米田防治闊葉雜草和部分禾本科雜草。
近日，江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所的研究團(tuán)隊在《Plant Communications》在線發(fā)表了題為“CRISPR/Cas9-mediated editing of OsHPPD 3’-UTR confers enhanced resistance to HPPD-inhibiting herbicide in rice”的研究論文，介紹了研究團(tuán)隊利用CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a基因編輯系統(tǒng)對水稻HPPD抑制劑抗性基因OsHPPD的3’-UTR進(jìn)行基因編輯，創(chuàng)造了水稻HPPD抑制性除草劑抗性新種質(zhì)材料，且沒有產(chǎn)生其他農(nóng)藝性狀的不利影響。
基因編輯已成為快速改進(jìn)作物的有力工具，水稻的多個農(nóng)藝性狀基因已被成功編輯?；蚓庉嫅?yīng)用多是針對基因編碼序列（CDS）或特定基因的啟動子區(qū)域。然而，一些基因由于其特殊的功能，其CDS和啟動子區(qū)域不能被編輯。相比之下，3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）是一個非編碼的mRNA片段，參與基于mRNA的調(diào)控過程，包括mRNA的定位、穩(wěn)定和翻譯。此外，3′-UTRs還能調(diào)控許多蛋白質(zhì)的特性，包括蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成、轉(zhuǎn)錄后修飾和蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。因此，3′-UTRs對高等生物的多個生物學(xué)過程至關(guān)重要，是潛在的基因編輯區(qū)域，可應(yīng)用來創(chuàng)制新的水稻種質(zhì)。
為了驗證這一假設(shè)，研究團(tuán)隊嘗試用CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a系統(tǒng)編輯OsHPPD基因的3'-UTR，創(chuàng)造HPPD抑制劑類除草劑抗性的水稻材料。在水稻中，OsHPPD（LOC_Os02g07160）包含一個265bp片段長度的3′-UTR（圖1A）。為了評估OsHPPD基因3′-UTR中的哪些突變可能引起MST抗性，研究團(tuán)隊使用在線工具（http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR/CRISPR）在265bp的3′-UTR內(nèi)選擇了10個目標(biāo)位點（TS1-TS10）進(jìn)行編輯（圖1B）。研究團(tuán)隊將得到的10個單向?qū)NAs（sgRNAs）分別克隆到CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a載體，然后將這些載體通過農(nóng)桿菌導(dǎo)入粳稻栽培品種Yanggeng3012（YG3012）中，該品種適合種植在中國江蘇省。最終，研究團(tuán)隊獲得了135個靶位點突變的T2個體（來源于97個T0轉(zhuǎn)化體）（圖1C）。
圖1A-C OsHPPD基因示意圖及其3′-UTR的編輯位點和編輯事件
研究團(tuán)隊使用硝磺草酮（MST）來測試T2個體的除草劑抗性。為了確定田間條件下合適的MST劑量，研究團(tuán)隊在施用11種不同劑量的MST后，對10個秈稻品種和10個粳稻品種的存活率進(jìn)行了測量。結(jié)果顯示，秈稻品種對MST的敏感性高于粳稻品種。在施用45 g ai ha-1 濃度的MST后，秈稻品種和粳稻品種的平均存活率分別為50.5%和84.25%。提高M(jìn)ST的濃度會導(dǎo)致植株成活率顯著下降。在施用120 g ai ha-1濃度MST后，粳稻品種和秈稻品種的平均存活率分別為2.95%和3.5%（圖1D）。因此，研究團(tuán)隊最終選用120 g ai ha-1濃度的MST來評估所有135個T2突變體品系在田間條件下的除草劑抗性。經(jīng)過14天的處理，只有兩個品系（TS8-2#和TS8-8#）能夠存活，而其他133個T2品系和野生型材料均已死亡（圖1E）。
圖1D&E施用階梯濃度MST后不同粳稻和秈稻品種的存活率
通過一代測序，研究團(tuán)隊驗證了TS8-2#和TS8-8#中sgRNA靶位點確實發(fā)生了編輯突變。值得注意的是，這兩個抗性品系是在同一個位點產(chǎn)生了突變。其中，TS8-2#是純合子，在2304位置有一個1bp的缺失，而TS8-8#是雜合子（WT/+1），在第2304位有1bp的插入（圖1F）。研究團(tuán)隊通過PCR測序最終選擇了兩個無轉(zhuǎn)基因的純合子編輯系（TS8-2#-10和82TS8-8#-6）用于后續(xù)分析（圖1G、H）。
圖1F-H TS8-2#和TS8-8#中sgRNA靶位點編輯突變情況
為了進(jìn)一步研究TS8-2#-10和TS8-8#-6的抗性水平，研究團(tuán)隊在溫室條件下測試TS8-2#-10、TS8-8#-6以及野生型對不同MST劑量的反應(yīng)。MST劑量梯度為0、0.125×、0.25×、0.5×、1×、2×、4×和8×，其中1×代表120 g ai ha-1。在施用480g ai ha-1濃度的MST后，野生型植株全部死亡，而TS8-2#-10和TS8-8#-6植株則存活下來，并達(dá)到未處理對照植株鮮重的44.2%和29.8%（圖1I）。據(jù)此，研究團(tuán)隊繪制了植株鮮重的MST劑量反應(yīng)曲線，作為計算MST GR50值（使生長減少50%的除草劑劑量）的函數(shù)曲線（圖1J）。野生型的GR50值為71.14±6.12 g ai ha-1，比TS8-2#-10（338.63±26.33 g ai ha-1）和TS8-8#-6（263.87±19.34 g ai ha-1)的GR50值低得多?；诳剐灾笖?shù)（RI）的計算值，基因編輯品系TS8-2#-10和TS8-8#-6對HPPD抑制性除草劑表現(xiàn)出的抗性水平分別是野生型抗性的4.8倍和3.7倍。
圖1I&J TS8-2#-10、TS8-8#-6以及野生型對不同MST劑量的反應(yīng)
為了確定兩個抗MST除草劑基因編輯品系是否對其他農(nóng)藝性狀產(chǎn)生不利影響，研究團(tuán)隊對未施用MST除草劑的田間條件下的植株農(nóng)藝性狀進(jìn)行了測定。
結(jié)果顯示，MST抗性株系TS8-2#-10和TS8-8#-6與野生型株系之間沒有明顯的表型差異（圖1K）。這表明編輯水稻OsHPPD基因3′-UTR特定位點可以增加MST抗性，但不影響其他農(nóng)藝性狀。
圖1K TS8-2#-10、TS8-8#-6與野生型的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)
綜上所示，本研究通過對水稻OsHPPD基因3'-UTR進(jìn)行位點基因編輯，創(chuàng)造了水稻HPPD抑制性除草劑抗性新種質(zhì)材料，且沒有產(chǎn)生其他農(nóng)藝性狀的不利影響。此外，本研究強(qiáng)調(diào)了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的優(yōu)良基因3'-UTR基因編輯，可以促進(jìn)植物重要農(nóng)藝性狀的改良。
—— 參考文獻(xiàn) ——
Wu Y, Xiao N, Cai Y, et al. CRISPR/Cas9-mediated editing of OsHPPD 3'-UTR confers enhanced resistance to HPPD-inhibiting herbicide in rice[J]. Plant Communications, 2023, 100605.
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