水稻是世界上最重要的糧食作物之一，是一半人口的主食，生產上常受到稻瘟病、紋枯病等多種病害威脅。由稻瘟病菌引起的稻瘟病每年造成的產量損失可以養(yǎng)活6000多萬人。水稻適用于基因編輯技術，培育抗病特別是廣譜抗病水稻品種，是實現(xiàn)作物病害綠色防控的有效措施。
2023年6月14日，Nature發(fā)表了華中農業(yè)大學李國田教授團隊牽頭完成的題為“Genome editing of a rice CDP-DAG synthase confers multipathogen resistance”的研究論文，該團隊通過篩選病變模擬突變體(LMM)克隆到了“RBL1”廣譜抗病基因，此突變體具有廣譜抗病性但會造成嚴重減產。通過靶向基因編輯RBL1，獲得了rbl1Δ12突變體，并經多年田間試驗評估，該突變體具有廣譜抗病性，但不會降低產量。
研究團隊首先從KitaaKe水稻1500多份已全基因組測序的快中子誘變系中，篩選到了稻瘟菌抗性增強的名為rbl1的LMM，但該突變體具有低育性（圖1a-f）。接種稻瘟菌后，與KitaaKe相比，真菌菌絲在rbl1中的傳播受到限制，rbl1表現(xiàn)出ROS的顯著上調、水楊酸的積累和植物防御相關基因的激活（補充圖2）。對rbl1植株的分離群體進行遺傳分析和測序，在RBL1基因中發(fā)現(xiàn)了一個29個堿基對(bp)的缺失(LOC_Os01g55360)（圖1j）。蛋白序列分析和遺傳互補實驗證實RBL1是致病基因（圖1k-p）。此外通過組織定量實驗和GUS染色分析可知，RBL1在所有組織中轉錄，在葉片中含量最高，且其表達受到稻瘟菌感染的誘導。
補充圖2 rbl1株系的植物防御相關基因表達、產量及遺傳互補實驗
圖1 從具有增強免疫的LMM rbl1中克隆到RBL1基因
為鑒定RBL1的生物學功能，通過酵母實驗和脂質組學分析，RBL1作為一種完整的膜蛋白，具有CDP-DAG合成酶的功能（圖2 a-c）。利用脂質組學技術在rbl1和KitaaKe水稻中測定CDS1相關的植物甘油酯代謝途徑上的脂類，相對KitaaKe，rbl1水稻中磷脂酸（PA）和DAG的含量升高，磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰甘油（PG）的水平顯著降低（圖2d）。且磷脂酰肌醇的減少是磷脂改變最顯著的結果（圖2e）。補充圖1 與胞苷二磷酸-甘油二酯合成酶1（CDS1）相關的植物甘油脂代謝途徑為了測試外源性補充磷脂是否可以挽救LMM表型，我們進行了化學互補試驗，觀察到外源添加磷脂酰肌醇的培養(yǎng)基，推遲了rbl1的病斑形成，而磷脂酸加速了的病斑形成(補充圖5a - d)。將呼吸爆發(fā)氧化酶同源蛋白( RBOH ) 抑制劑二亞苯基碘化銨應用于rbl1，可以緩解LMM表型(補充圖5e)。補充圖5 外源添加磷脂酰肌醇延緩了rbl1的病斑形成為了測試增加磷脂酰肌醇的含量是否可以挽救LMM表型，研究團隊在rbl1中過表達水稻PIS1（OsPIS1）。與rbl1相比，OsPIS1：：rbl1系中的病斑比例減少（圖）。2f-i），病程相關（PR）基因的表達量和稻瘟菌抗性降低，但高于KitaaKe（圖2f-j）。同時OsPIS1::rbl1植株的磷脂酰肌醇含量恢復到KitaaKe的80%，PtdInsP和PtdInsP2的含量完全恢復（圖2k）。同樣在rbl1中過表達了磷脂酸磷酸水解酶編碼基因OsPAH2(圖2i)。OsPAH2::rbl1系中磷脂酸含量恢復，PR基因的表達水平僅略有下降，病斑比例和稻瘟菌抗性沒有改變(圖2m - o)。這表明rbl1中磷脂酸水平的升高僅以有限的方式有助于增強免疫力。因此該團隊隨后的研究重點放在磷脂酰肌醇衍生物上。圖2 RBL1作為CDP - DAG合成酶發(fā)揮功能，rbl1中磷脂酰肌醇水平升高能更好地平衡抗性和生物量。脂質印跡結果顯示在rbl1植物中膜PtdIns(4,5)P2減少（圖3a，b），為進一步分析真菌侵染過程中PtdIns(4,5)P2在原位的時空變化，研究團隊構建了表達PtdIns(4,5)P2生物傳感器的穩(wěn)定轉基因水稻品系。在Kitaake中沿質膜均勻分布，但在rbl1中，PtdIns(4,5)P2在質膜上的信號微弱，并存在于未知囊泡中（圖3c），蛋白印跡Western blotting結果和熒光信號顯著降低(圖3d,e)。在稻瘟菌侵染后，PtdIns(4,5)P2迅速響應并聚集在侵入型菌絲尖端并侵襲外菌絲膜(EIHM)上（圖3g,h），富集在BIC感染特異性結構中（圖3i），但在rbl1中的細胞質未觀察到，BIC形成率僅7.1%，遠低于Kitaake的93.3%。綜合來看PtdIns（4,5）P2在真菌和水稻的相互作用中發(fā)揮重要作用。圖3 rbl1植株中富集在侵染特異性結構中Ptd Ins ( 4,5)P2減少rbl1株系具有廣譜抗病性，但產量降低了約20倍，為了平衡抗病性和產量，通過多重基因組編輯來構建和篩選編輯株系，發(fā)現(xiàn)12個堿基缺失的rbl1Δ12株系，表現(xiàn)出微小超敏反應樣病變，且產生正常的種子（圖4c，d），對10個稻瘟菌、5個Xoo菌株和2個稻曲病菌的菌株具有抗性（圖4 e-j）。相應地，與Kitaake相比，rbl1Δ12感染稻曲病菌的穎花中真菌毒素水平降低了66.2 % (圖4i )。通過無轉基因種子進行大田試驗，在不同地區(qū)低稻瘟菌的水稻產區(qū)種植，評估了多個關鍵農藝性狀，株高、單株分蘗數、結實率、千粒重和籽粒產量。除株高外，rbl1Δ12和Kitaake的所有測量性狀無明顯差異。綜上所述，Kitaake水稻的RBL1Δ12等位基因具有強大的廣譜抗病性，而不會降低產量。圖4 rbl1Δ12具有廣譜抗病性，且在田間試驗中沒有觀察到產量損失rbl1Δ12中缺失的4個氨基酸具有保守性，ROS水平響應幾丁質與其他水稻類似，此外RBL1基因表達水平顯著降低（補充圖7b-d）。RBL1可回補rbl1Δ12，但rbl1Δ12不能回補rbl1（補充圖7j-i），與rbl1Δ12與Kitaake雜交的F2群體中稻瘟病菌抗性表現(xiàn)也證實了互補結果，說明RBL1位點以反向劑量調節(jié)來促進免疫力（補充圖7m-o）。此外研究團隊在兩個水稻品種“日本晴”和“中華11號”中生成了RBL1編輯的株系，稻瘟病菌抗性增強，生長正常，類似于rbl1Δ12(補充圖9)。本研究結果揭示了磷脂代謝與抗病性的關系，獲得了具有廣譜抗病性但不降低產量的株系，表明了微調參與感染特異性結構形成的宿主因子是平衡免疫力和產量的策略，為作物抗病研究方向做出重要參考，應加大基因編輯技術對負調節(jié)因子的改造利用，且對不同的LMM基因和作物具有重要的參考價值。華中農業(yè)大學農業(yè)微生物資源發(fā)掘與利用全國重點實驗室、湖北洪山實驗室李國田教授和加州大學戴維斯分校/勞倫斯伯克利國家實驗室Pamela C. Ronald院士為該論文共同通訊作者。李國田教授團隊博士研究生沙干、孫鵬為本論文共同第一作者。西北農林科技大學康振生院士、法國波爾多大學Yohann Boutté教授、作物遺傳改良全國重點實驗室郭亮教授、李強教授和謝卡斌教授、江西省農業(yè)科學院水稻研究所黃仁良副研究員、農業(yè)微生物資源發(fā)掘與利用全國重點實驗室鄭露副教授、深圳華大生命科學研究院丘璨瑜副研究員、山東省農科院徐建第研究員、澳大利亞阿德萊德大學Jenny Mortimer教授等國內外科研機構研究人員參與了合作研究。
—— 參考文獻 ——
Sha, G., Sun, P., Kong, X., et al. Genome editing of a rice CDP-DAG synthase confers multipathogen resistance[J]. Nature, 2023, 618, 1017–1023.
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