隨著全球氣候變化，可能會(huì)加劇作物疾病的爆發(fā)，如水稻的稻曲病。稻曲?。≧FS）是由活體營(yíng)養(yǎng)型病菌Ustilaginoidea virens（U. virens）引起的水稻穗部真菌病害，在全球范圍內(nèi)的水稻產(chǎn)區(qū)內(nèi)廣泛存在，目前防治這一疾病的戰(zhàn)略主要依賴于使用合成殺菌劑，這會(huì)對(duì)環(huán)境和人類健康構(gòu)成潛在風(fēng)險(xiǎn)，利用植物微生物群防治已成為促進(jìn)植物健康和控制疾病的可持續(xù)方法。寄主植物與其微生物群之間的互惠作用可提供抗病性，這種相互作用的研究一般集中在根際微生物之間，植物地表的微生物群如何提供抗病性仍不清楚。浙江大學(xué)農(nóng)學(xué)院王蒙岑課題組在植物抗病防御機(jī)制上取得新成果，近期在微生物領(lǐng)域國(guó)際著名期刊《Nature Microbiology》發(fā)表了“Phyllosphere microbiome induces host metabolic defence against rice false-smut disease”的研究論文。入選《Nature Reviews Microbiology》研究亮點(diǎn)（鏈接：https://doi.org/10.1038/s41477-023-01470-5）。該成果解析了宿主植物與穗部微生物互作防御病原菌侵染的作用機(jī)制。該研究通過(guò)整合微生物群落多樣性測(cè)序，初級(jí)代謝分析，真菌毒素的定性定量分析、宿主基因組編輯、微生物移植試驗(yàn)和生化、遺傳學(xué)等技術(shù)手段，發(fā)現(xiàn)具有穗部核心菌群的植物以抑制支鏈氨基酸（BCAAs）依賴性方式來(lái)防御稻曲病菌的侵染，且田間試驗(yàn)表明，亮氨酸與50%殺菌劑聯(lián)合使用實(shí)現(xiàn)高濃度殺菌劑的防治效果。在RFS爆發(fā)期間，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)同一水稻品種在同一地點(diǎn)的相鄰田塊出現(xiàn)發(fā)病與抑病兩種相反的穗部性狀。發(fā)病植株（DPs）和抗病植株（DSPs）兩個(gè)地塊的U. virens主要侵染源的種群密度無(wú)差異，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)了發(fā)病和抑病植物的根際微生物群落組成和多樣性無(wú)差異。在對(duì)穗部微生物群落分析時(shí)，抗病植株上發(fā)現(xiàn)了獨(dú)特的穗部微生物群落，發(fā)病植株的穗部細(xì)菌群落豐度顯著高于抑病植株，但多樣性相反（圖1a，b），在真菌群落上，抑病植物的豐度和多樣性顯著高于發(fā)病植物（圖1d，e），基于Beta多樣性的主坐標(biāo)分析(PCoA)進(jìn)一步揭示了這種差異（圖1c，f）。對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌分析，發(fā)病植株中為綠核菌屬和鐮刀菌屬，抑病植株中依次為曲霉、黑孢屬和莫氏黑粉菌屬（圖1g）。在細(xì)菌屬上，乳酸桿菌和萊夫森菌是抑病植物所特有的（圖1h）。微生物共生網(wǎng)絡(luò)各種特征均相似，因此假設(shè)獨(dú)特的穗部微生物群與宿主相互作用，從而對(duì)疾病抑制產(chǎn)生影響。
圖1 水稻發(fā)病株和抑病株的穗部微生物組分析為分析水稻穗部的獨(dú)特微生物群落的宿主的相關(guān)性，對(duì)發(fā)病株和抑病株的穗部局部代謝進(jìn)行分析。其中總蛋白和可溶性糖沒(méi)有顯著差異（圖2 a，b），但亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸在內(nèi)的支鏈氨基酸在抗病植物的穗中顯著富集（圖2c）。通過(guò)穗部真菌毒素的定性和定量分析來(lái)研究外源代謝線索，在發(fā)病株中檢測(cè)出稻曲病菌毒素包括A、B、C、D和F，呈下降趨勢(shì)，抑病株中的稻曲病菌毒素A含量極低（圖2d）。進(jìn)一步分析結(jié)果表明，稻曲病菌毒素A的積累與15種氨基酸呈正相關(guān)，與支鏈氨基酸呈負(fù)相關(guān)（圖2 e，f），其中與在穗部的優(yōu)勢(shì)支鏈氨基酸亮氨酸的高度負(fù)相關(guān)。該研究接下來(lái)主要關(guān)注改變的支鏈氨基酸這個(gè)獨(dú)特的代謝線索。
圖2 微生物群落結(jié)構(gòu)特異性的水稻穗的局部代謝圖譜為進(jìn)一步分析微生物群落與支鏈氨基酸之間的相互作用，對(duì)抑病株穗部的微生物進(jìn)行分離，獲得了2357個(gè)微生物分離株，其中31個(gè)株具有抑病能力。對(duì)這些具有抑病能力的分離株進(jìn)行鑒定并分類為11個(gè)屬，還推斷出在抑制疾病的植物的穗部顯著富集的微生物類群（圖3 a，b）。從抑制疾病的關(guān)鍵微生物類群，選取6株具有最高抑病率（>80%）的微生物分離株，分析它們與支鏈氨基酸的關(guān)系及抑病意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，關(guān)鍵類群成功定植后穗部的亮氨酸水平明顯升高（圖3c）。且隨著亮氨酸水平的升高，BCAA轉(zhuǎn)氨酶基因（OsBCAT）的表達(dá)量在穗中受到抑制（圖3d）。
圖3 支鏈氨基酸、微生物群和水稻穗部疾病抑制之間相互作用解析利用CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)，該團(tuán)隊(duì)在水稻中成功獲得了OsBCAT突變體，突變體的OsBCAT基因和蛋白序列如圖（圖3 e-g）。與野生型（WT）相比，OsBCAT突變體（Osbscat）的穗部亮氨酸水平明顯增加，表明OsBCAT負(fù)調(diào)控水稻穗部BCAA水平（圖3 h）。且與野生型相比，Osbcat突變體對(duì)U. virens的抗性顯著增加，外源亮氨酸的補(bǔ)充和高抑病能力菌株的定植也使得WT對(duì)U. virens的抗性增加（圖3 i），但關(guān)鍵分類群定植沒(méi)有進(jìn)一步增加的Osbcat突變體的抑病能力，說(shuō)明水稻穗部中微生物群介導(dǎo)的疾病抑制是依賴于BCCAs的。為了闡明BCAAs抑制U. virens感染的具體作用模式，該團(tuán)隊(duì)研究了BCAAs抑制U. virens引起的水稻穗部RFS發(fā)病的劑量依賴性效應(yīng)，結(jié)果表明，亮氨酸以劑量依賴性的方式抑制了U. virens稻曲球的形成（圖4 a-f）。此外田間試驗(yàn)，亮氨酸與化學(xué)殺菌劑聯(lián)用在減少了50%的殺菌劑用量下獲得了良好的防治效果。在體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，亮氨酸對(duì)U. virens菌絲體生長(zhǎng)的抑制作用呈劑量依賴性（圖4 g）。通過(guò)光學(xué)顯微鏡、電鏡和相機(jī)觀察發(fā)現(xiàn)暴露在亮氨酸條件下的U. virens在微觀尺度(圖4 h-m)和宏觀尺度(圖4 n-r)上都出現(xiàn)了明顯的形態(tài)學(xué)缺陷。共聚焦檢測(cè)結(jié)果顯示在亮氨酸暴露條件下的U. virens的細(xì)胞核中觀察到濃縮的染色質(zhì)（圖4 1,m），這說(shuō)明發(fā)生了凋亡樣細(xì)胞死亡，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，定量分析，DNA Ladder和DNA片段的跑膠均證實(shí)了這種凋亡性細(xì)胞死亡現(xiàn)象（圖4 s-w)。綜上所述，升高的BCAAs導(dǎo)致了U. virens細(xì)胞功能障礙，從而抑制了穗中的RFS。
圖4 支鏈氨基酸暴露下條件下U. virens細(xì)胞功能失調(diào)的表征該研究進(jìn)一步通過(guò)RNA-seq分析確定了暴露于亮氨酸后U. virens轉(zhuǎn)錄組的全局變化。結(jié)果表明，BCAAs誘導(dǎo)了U. virens的轉(zhuǎn)錄組重編程，511個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生了差異表達(dá)。通過(guò)GO通路富集分析表明，U. virens中被抑制的轉(zhuǎn)錄本主要參與真菌毒素生物合成、效應(yīng)物、病原體-宿主相互作用和假設(shè)的致病性相關(guān)基因等過(guò)程（圖5 a，b），也存在與細(xì)胞凋亡樣細(xì)胞死亡相關(guān)的差異表達(dá)基因（圖5 c），如U. virens中顯著上調(diào)的丙酮酸代謝基因（UvKm1），抗氧化劑相關(guān)基因（UvATO2）和顯著下調(diào)的氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)基因（UvAaT1）。此外觀察到U. virens中l(wèi)-氨基酸氧化酶編碼基因（UvLAO2）的表達(dá)量顯著增加。此外，該研究發(fā)現(xiàn)H2O2外源處理可誘導(dǎo)U. virens細(xì)胞凋亡樣死亡，而抑制細(xì)胞內(nèi)H2O2過(guò)量產(chǎn)生可顯著降低U. virens細(xì)胞凋亡樣死亡率（圖 5f），這些結(jié)果闡明了過(guò)量產(chǎn)生的H2O2在凋亡樣細(xì)胞死亡中的重要作用。該研究已經(jīng)觀察到這些H2O2引起的U. virens細(xì)胞凋亡樣死亡的標(biāo)記基因UvLAO2。靶向敲除UvLAO2后，U. virens中ΔUvlao2相比于野生型，H2O2積累顯著減少，水稻穗上的致病性增強(qiáng)，對(duì)亮氨酸的敏感性降低（圖5 g-h）。因此，UvLAO2介導(dǎo)的H2O2過(guò)量產(chǎn)生參與了BCCAs誘導(dǎo)的U. virens細(xì)胞功能障礙。更為有趣的是其他BCAAs，包括纈氨酸和異亮氨酸，也結(jié)合到UvLAO2相同的結(jié)構(gòu)域，但親和與作用位點(diǎn)不同（圖5 i）。且纈氨酸和異亮氨酸具有一定的誘導(dǎo)H2O2積累和抑制U. virens感染的功能。綜上所述，UvLAO2負(fù)向調(diào)節(jié)了U. virens的致病性，UvLAO2介導(dǎo)的H2O2過(guò)量產(chǎn)生是BCAA抑制U. virens在穗部感染的原因。
圖5 U. virens中亮氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞功能障礙的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析該成果破譯了宿主植物與穗部微生物聯(lián)合防御病原菌侵染的分子機(jī)制，闡明了作物病害控殘減毒防控技術(shù)的新靶點(diǎn)，為作物抗病品種的分子設(shè)計(jì)改良提供了新資源。—— 參考文獻(xiàn) ——
Liu, X., Matsumoto, H., Lv, T, et al. Phyllosphere microbiome induces host metabolic defence against rice false-smut disease[J]. Nature Microbiology, 2023.
Agripheno?高通量基因分型檢測(cè)平臺(tái)Agripheno?高通量基因分型檢測(cè)平臺(tái)包括高通量Oktopure DNA提取儀、Nexar?模塊化內(nèi)聯(lián)液處理與分析系統(tǒng)、Soellex?高通量PCR水浴熱循環(huán)系統(tǒng)和Araya?內(nèi)聯(lián)熒光檢測(cè)系統(tǒng)。Oktopure DNA提取儀采用磁珠的方法提取DNA，通量達(dá)到800個(gè)樣本/3小時(shí)。同時(shí)，適用于多種樣本類型的DNA提取，包括植物葉片、種子，毛發(fā)、血方卡、精液、口拭子、唾液、組織等。提取的DNA適用于多種下游應(yīng)用，如基因分型、一代測(cè)序、二代測(cè)序等。Nexar高通量吸取樣品DNA和引物、mix至384孔卷帶并封膜。Soellex對(duì)封膜完成的卷帶進(jìn)行PCR水浴熱循環(huán)，每次最多可達(dá)230,000個(gè)樣本。Araya對(duì)水浴完成的卷帶掃描分析，28秒掃描一張卷帶。Agripheno?基因分型采用KASP（Kompetitive Allele Specific PCR）原理，對(duì)目標(biāo)SNPs和InDels進(jìn)行精準(zhǔn)的雙等位基因分型。反應(yīng)體系僅1.6μl，具有高通量、低成本，準(zhǔn)確率和檢出率接近100%的明顯優(yōu)勢(shì)。
| ● 客戶須提供每個(gè)位點(diǎn)至少10個(gè)陽(yáng)性對(duì)照 |
| ● 服務(wù)周期引物測(cè)試完成后，每批樣品一周內(nèi)出結(jié)果 |
| ● 服務(wù)特點(diǎn)：高通量、低成本、快速準(zhǔn)確 |
DNA提取服務(wù)
針對(duì)玉米、大豆及水稻等作物的不同組織/器官（葉片、種子等），利用標(biāo)準(zhǔn)的SDS/CTAB法和磁珠法開展DNA提取工作，可實(shí)現(xiàn)單日普通質(zhì)量10,000份和高質(zhì)量5,000份的DNA提取。
分子標(biāo)記開發(fā)與檢測(cè)服務(wù)根據(jù)目標(biāo)DNA/基因序列,可開發(fā)高效的分子標(biāo)記（SNP-KASP、SSR等），并可實(shí)現(xiàn)單日最高一萬(wàn)SSR數(shù)據(jù)點(diǎn)，以及數(shù)以十萬(wàn)計(jì)的SNP數(shù)據(jù)點(diǎn)檢測(cè)。
基因組育種芯片是將大規(guī)模的基因組測(cè)序、功能基因組研究的最新成果與國(guó)際最先進(jìn)的SNP芯片技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建的服務(wù)于育種的基因組技術(shù)工具。目前，種業(yè)芯片檢測(cè)平臺(tái)，可以提供依托于Affymetrix基因芯片平臺(tái)的固相芯片檢測(cè)服務(wù)（如Maize-6H60K、Maize-6H90K、Soybean-180K等）、以及依托于華大智造MGISEQ-2000檢測(cè)平臺(tái)的液相芯片檢測(cè)服務(wù)。兩大檢測(cè)平臺(tái)技術(shù)路線如下：
靶向測(cè)序服務(wù)
靶向測(cè)序技術(shù)主要分為基于多重PCR的靶向基因捕獲技術(shù)（GenoPlexs）和基于液相探針雜交的靶向基因捕獲技術(shù)（GenoBaits）兩種。可完成單樣品50-5000和3000-40000標(biāo)記的基因型分析，并達(dá)到可設(shè)計(jì)區(qū)域覆蓋度高于95%，擴(kuò)增子均一性高于90%的捕獲效率。
GenoPlex基于多重PCR的靶向基因捕獲技術(shù)方案
GenoBaits基于液相探針雜交的靶向基因捕獲技術(shù)方案
如您需要了解更多信息，請(qǐng)識(shí)別下方二維碼填寫登記表，我們會(huì)為您提供專業(yè)的服務(wù)，真誠(chéng)期待與您的合作！
相關(guān)閱讀：
? 中國(guó)科研團(tuán)隊(duì)通過(guò)基因編輯獲得具有廣譜抗病性且穩(wěn)產(chǎn)的水稻株系
? 玉米廣譜抗性新基因ZmNANMT，豐富了玉米遺傳育種的抗病基因庫(kù)
