? 將自動流式細(xì)胞儀與圖像處理的細(xì)胞圖像流相結(jié)合，可以估算藻細(xì)胞生長率; ? 凱倫藻（Karenia selliformis）在赤潮期間表現(xiàn)出低生長率; ? 在藻華期間，Karenia selliformis可能存在磷限制; ? 潮汐動態(tài)在Karenia selliformis生物量積累中起著關(guān)鍵作用。
2019年秋季，在加貝斯灣（地中海）發(fā)生了一次凱輪藻（Karenia selliformis）赤潮事件，利用配備流動成像模塊的自動流式細(xì)胞儀（Cytosense, Cytobuoy b.v.）進(jìn)行了為期9天的高頻監(jiān)測。該儀器記錄了光學(xué)信號的形狀，從而分辨了有害藻類大量繁殖期間的六個細(xì)胞群，包括微微型浮游植物 (picophytoplankton)，微型浮游植物 (nanophytoplankton)和小型植物型浮游植物 (microphytoplankton)。通過分析每小時記錄得到的凱輪藻細(xì)胞尺寸，估算了赤潮期間的日分裂率。結(jié)果顯示，凱倫藻是唯一形成赤潮的物種，并在調(diào)查的第四天達(dá)到了最高的平均豐度。營養(yǎng)鹽組成發(fā)生了變化，赤潮爆發(fā)期可能存在磷（P）限制，而大赤潮衰退期可能存在氮（N）限制。協(xié)慣量分析顯示，凱倫藻和異養(yǎng)原核生物呈相反的模式，表明了它們之間的營養(yǎng)相互作用以及赤潮結(jié)束時凱倫藻可能出現(xiàn)混合營養(yǎng)行為。凱倫藻的生長率普遍較低，通常日分裂率<1/d，此數(shù)值無法解釋觀察到的高豐度。潮汐在半日和春潮-露潮尺度上對凱倫藻動態(tài)起著至關(guān)重要的作用，并可能增強(qiáng)了凱倫藻的積累。在這項研究中，報告了對加貝斯灣中凱倫藻進(jìn)行高頻率原位監(jiān)測的結(jié)果。以小時為單位時間尺度對赤潮動態(tài)進(jìn)行了調(diào)查，以解決以下問題：（1）觀察到的赤潮是否為單一種類，并且是否與其他浮游植物群體，尤其是超微型浮游植物（<10 μm），存在相互作用？（2）凱倫藻在赤潮期間的養(yǎng)分需求是什么，赤潮期間養(yǎng)分組成是否發(fā)生了變化？（3）在赤潮期間，高生物量是否由純物理過程維持，還是由于種群的內(nèi)在固有特征（即，高生長率）？取樣是在2019年秋季（從9月27日至10月5日）在突尼斯斯法克斯（Sfax）的商業(yè)港口進(jìn)行的，此前當(dāng)?shù)卣畧蟾媪怂w變色情況。斯法克斯港口位于加貝斯灣北岸的工業(yè)區(qū)域內(nèi)，該地區(qū)是突尼斯海岸沿線赤潮事件的主要熱點區(qū)域（見圖1）。大多數(shù)事件發(fā)生在秋季和春季，而主要的有害赤潮物種是凱倫藻屬（Karenia selliformis）（Feki等人，2017年）。盡管屬于東地中海盆地寡營養(yǎng)區(qū)，但加貝斯灣非常富有生產(chǎn)力，占突尼斯?jié)O業(yè)生產(chǎn)的65％（DGPA，2005–2009）。它是海龜?shù)闹麠⒌兀↗ribi等人，2008年；Lotze和Worm，2009年；Maffucci等人，2006年）。盡管加貝斯灣對當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)和野生動物保護(hù)具有特殊重要性，但仍然受到城市化、工業(yè)、漁業(yè)、旅游和人為排放的強(qiáng)大壓力（B′ejaoui等人，2004年；Ben Brahim等人，2010年；Rekik等人，2012年）。
采樣使用手持式多參數(shù)儀器（WTW Multi 340i/SET）對溫度、鹽度和pH進(jìn)行了每小時的測量。潮汐振幅，即高潮和落潮之間的差異，被視為表示潮汐影響的變量，從位于斯法克斯港口的潮汐測站獲取，由突尼斯海洋水文和海洋服務(wù)部門運(yùn)營。從3米深處使用一臺5馬力的潛水電泵連續(xù)將港口的亞表層海水泵入。每3小時收集一次營養(yǎng)分析樣品，裝入清潔的50 cm3聚碳酸酯瓶中，并立即存放在-80°C。1. 采用高頻率采樣（1小時間隔）模式來監(jiān)測浮游植物動態(tài)。使用了Cytosense自動流式細(xì)胞儀（Cytobuoy b.v. (NL)），該設(shè)備設(shè)計用于研究0.8-800 μm之間的單個或群體浮游植物細(xì)胞。Cytosens分析了來自連續(xù)流通系統(tǒng)的海水，該系統(tǒng)以3米深處抽取，流速為1dm3/min，將樣品導(dǎo)入中間的300cm3容器進(jìn)行隔離并盡量減少分析涵蓋的體積。使用重量校準(zhǔn)的蠕動泵將樣品流速設(shè)置為5 mm3/s，導(dǎo)入鞘液循環(huán)（經(jīng)過0.2 μm過濾的NaCl溶液（35‰）），細(xì)胞在流動軸方向被分離和排列，然后被激光束（OBIS Coherent，488 nm，120 mW）檢測。使用兩個0.1 μm過濾器的組合不斷回收鞘液。前向光散射（FWS）被收集到兩個左右光電二極管上，并用于激光對準(zhǔn)控制。側(cè)向光散射（SWS）和熒光發(fā)射通過一組光學(xué)濾波器（SWS（488 nm），黃色熒光（FLY，506–601 nm），橙色熒光（FLO，601–650 nm）和紅色熒光（FLR，> 650 nm））分離并收集到光電倍增管上。每24-72小時使用直徑為3μm（Cyto-Cal?）和10μm（Polybead?）的熒光珠進(jìn)行熒光和大小的校準(zhǔn)。硅膠珠（Bangs lab?，二氧化硅微球），直徑為1.0、2.02和3.13μm，用于估算浮游植物細(xì)胞的大小。2. 根據(jù)其光散射和熒光特性對浮游植物群進(jìn)行了光學(xué)分辨。對于每個樣品，記錄了兩次連續(xù)的分析，分別設(shè)置兩個不同的FLR信號（10和20 mV）觸發(fā)，以優(yōu)化低葉綠素含量和高葉綠素含量細(xì)胞的分析。浮游植物群落使用Cytoclus?軟件進(jìn)行分類。因此，每個細(xì)胞都通過一組光學(xué)脈沖形狀進(jìn)行表征，這構(gòu)成了細(xì)胞學(xué)特征。使用不同尺寸的微球珠區(qū)分了藍(lán)藻（光合原核生物）、微微型真核藻（picoeukaryotes）、微型浮游植物和小型浮游植物。3. 異養(yǎng)原核生物的豐度分析：每隔3小時，將1.8 cm3海水亞樣品立即用0.2 cm3 20％的多聚甲醛（PFA）溶液固定，使用死亡移液管（Vives-Rego等人，2000年），并放置在4°C的黑暗中15分鐘，然后在液氮-80°C存儲在，直到使用CyFlow space Partec流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，方法見Khammeri等人（2020年）。
4. 對于picoeukaryotes和 nanoeukaryotes，根據(jù)不同尺寸的的微球進(jìn)行預(yù)測量，與其等效的細(xì)胞學(xué)前向散射特征（FWS）之間的校準(zhǔn)關(guān)系，估算細(xì)胞生物體積。對于凱倫藻等細(xì)胞，細(xì)胞大小是通過儀器中的流動成像模塊生成的圖像確定的。使用Cytoclus 4軟件進(jìn)行細(xì)胞大小測量。使用此方法處理了超過200個圖像。然后建立了細(xì)胞生物體積與前向散射特征（FWS）之間的關(guān)系。對每個群體分配一個系數(shù)，將生物體積轉(zhuǎn)換為碳生物量。例如凱倫藻（Lessard，1991年）和藍(lán)細(xì)菌Synechococcus（Mackey等人，2002年）的系數(shù)分別為0.14 pg C/μm和200 fg C/cell。Picoeukaryotes 和 nanoeukaryotes碳生物量使用Verity等人（1992年）的方程計算：
Qc, cal = aV0.866
Qc, cal：估算的每個細(xì)胞的平均碳生物量(fg C/cell)，V：生物體積 (μm3)，“a”值不同物種不同,分別為: Synechococcus=0.39, picoeukaryotes=0.32, nanoeukaryotes=0.27, cryptophytes=0.25。
最小和最大平均細(xì)胞生物體積之間的比率已用于估計每日生長速率 (Binder等人，1996; Vaulot和Marie，1999)。這種方法假設(shè)，對于給定的群落，生長和分裂階段是同步的：
μratio = Log(Vmax / Vmin)
其中μratio是每日生長率（d-1），Vmax和Vmin分別是最大和最小的平均細(xì)胞生物體積（μm3/cell）。
表觀碳生物量的增加，定義為凈初級生產(chǎn)力（NPP），單位為mgC m3 d-1，使用碳轉(zhuǎn)換因子Qc, cal與N（豐度）和指數(shù)生長率的數(shù)量積進(jìn)行計算。
NPP=Qc, cal×[eμratio-1]×N
在取樣期間，溫度在27-30°C之間波動，最高值出現(xiàn)在赤潮期的前五天，赤潮結(jié)束時下降了1.5°C（圖2A）。平均鹽度相對穩(wěn)定，在39左右，但偶爾出現(xiàn)低于38.5的數(shù)值（圖2B）。pH值從赤潮開始的7.85變化到結(jié)束時的8.52（圖2C）。赤潮期間，氮主要以銨的形式存在，其濃度在0.25-18.91 μM的范圍內(nèi)變化（圖2D）。硝酸鹽和亞硝酸鹽的平均濃度在約2.17 μM左右波動。它們在第三和第四天顯示出超過4 μM，并在第六天達(dá)到了最大值9.5 μM。磷在赤潮初期（從第1天到第3天）相對較低，然后逐漸增加，在赤潮結(jié)束時顯示出最高值（4 μM）。N：P比值通常在赤潮開始階段（從第1天到第5天）高于16，顯示出潛在的磷限制，而在赤潮結(jié)束時（從第6天到第10天）低于16，表明可能存在氮限制（圖4）。硅酸鹽平均波動在4 μM左右，在赤潮期間相對穩(wěn)定，除了第4天記錄的單個高值（19 μM）。
根據(jù)材料和方法部分描述的細(xì)胞光學(xué)特性，通過流式細(xì)胞儀解析了六個浮游植物功能群（圖3）。在FLR vs. FLY和FLY vs. FWS圖上，區(qū)分了三個富含藻紅蛋白的聚類，通過其高FLY（藻紅蛋白）進(jìn)行區(qū)分。識別為Synechococcus的聚類6細(xì)胞，計算的大小估計為1.77 ± 0.05 μm。聚類3和聚類4的細(xì)胞的計算大小分別為3.32 ± 0.74和14.25 ± 2.09 μm，并分別識別為類隱藻和隱藻。Picoeukaryotes和 nanoeukaryotes細(xì)胞具有較高的FLR和低的FLY，計算的大小分別估計為2.11 ± 0.04和3.71 ± 0.22 μm。聚類1的細(xì)胞表現(xiàn)出最高的FLR，相對較低的FLY，計算的大小估計為31.2 ± 1.65 μm。對于聚類1收集的細(xì)胞圖片，首次將其識別為Karenia selliformis（圖3C）。通過16S rDNA V4序列的代謝條形碼和系統(tǒng)發(fā)育分析，進(jìn)一步證實了這一結(jié)果。在赤潮期間收集的5個樣品中，真核生物群落的多樣性分析顯示出存在14個作為Karenia屬的ASV（補(bǔ)充表1）。Karenia selliformis_ASV1是在監(jiān)測期間檢測到的最豐富的真核生物ASV，其相對豐度在赤潮期開始（第2天）和結(jié)束（第8天）之間變化，分別為45.20％至17.53％。其他Karenia ASVs的表示非常少，最大相對豐度<2％。屬于八個Kareniaceae物種的18S rDNA V4區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3D）顯示，主導(dǎo)的K. selliformis_ASV1序列與K. selliformis CAW79（100％一致）聚類，從而確認(rèn)了赤潮物種的識別為K. selliformis。
在監(jiān)測期間，Karenia selliformis的貢獻(xiàn)在聚類1中的減少也通過相機(jī)輸出圖像觀察到（檢查了200多塊板），顯示該物種在赤潮的前六天中占據(jù)了超過90％的微生物，而在赤潮結(jié)束時約為20％，并出現(xiàn)了其他微型浮游物種，如斜紋硅藻Pleurosigma sp.和一些纖毛蟲。K. selliformis的豐度在監(jiān)測期間波動在103至27 × 103 cell/cm3之間（圖4）。在第一個監(jiān)測日（2019年9月27日），Karenia selliformis的濃度在103至9 × 103個cell/cm3之間變化，這對應(yīng)于赤潮的良好生長階段（圖4）。最高濃度記錄在第5個監(jiān)測日（2019年10月1日），這對應(yīng)于春潮期。在此日期之后，濃度急劇下降，最終在監(jiān)測結(jié)束時達(dá)到約（103cell/cm3），對應(yīng)于退潮期，此時潮汐振幅變化小于1米。濃度的晝夜變化顯示，在高潮時記錄到最大值，而在低潮時記錄到最小值，證明了潮汐對赤潮的控制（圖4）。
Synechococcus和微型真核生物是最多的超微浮游植物群（見圖5），平均濃度約為104和2 × 103cell/cm3。它們在第一個監(jiān)測日展示了最高的濃度。Synechococcus的濃度在赤潮結(jié)束時急劇下降至< 102cell/cm3。類隱藻的濃度約為102cell/cm3，在赤潮結(jié)束時保持了穩(wěn)定的濃度，而更大的隱藻在赤潮結(jié)束時減少。異養(yǎng)原核生物的濃度平均波動在2 × 106cell/cm3左右，并沒有特定的變化趨勢。Karenia selliformis聚類在系統(tǒng)中占據(jù)了超過90%的碳生物量（見圖6），在第6天后，對碳生物量的貢獻(xiàn)減少到不到80%，而納米真核生物和隱藻的貢獻(xiàn)增加了（見圖6）。
3. Karenia selliformis的生長率和凈初級生產(chǎn)力Karenia selliformis細(xì)胞平均大小的晝夜變化顯示出相當(dāng)同步的分布，這意味著細(xì)胞的生長和分裂在時間上是分開的。大小變化呈現(xiàn)出明顯的晝夜變化模式（見圖7），與文獻(xiàn)描述相符（Weiler和Chisholm，1976）。細(xì)胞生長始于黎明（大約上午5點），記錄到的最小細(xì)胞大小約為28 μm，而細(xì)胞分裂主要發(fā)生在夜間（大約晚上7點），最大細(xì)胞大小約為33 μm。尺寸譜的分析（見圖7）顯示，群落在赤潮爆發(fā)期的指數(shù)階段顯示出同步分布，而在赤潮結(jié)束時非同步分布，可能是由于群落的多種構(gòu)成導(dǎo)致較大尺寸物種的出現(xiàn)（見圖8B）。
計算的生長速率在赤潮期的前幾天顯示出一般上升的趨勢（見圖8C），在第6天達(dá)到最大值，為0.76/d，相當(dāng)于每天超過1次分裂。在赤潮衰減期間，生長速率約為0.6/d。凈初級生產(chǎn)力（NPP）在赤潮增長階段顯示出下降趨勢，第6天達(dá)到約14 mg C/m3/day的最大值，然后在赤潮結(jié)束時迅速下降至小于0.5 mg C/m3/day（第9天）。
1. 建立長期監(jiān)測將對赤潮爆發(fā)、生長和崩潰的條件提供非常有用的信息。如果監(jiān)測站點是復(fù)發(fā)性HAB的熱點地區(qū)，例如被認(rèn)為加貝斯灣赤潮熱點的半封閉的Boughrara瀉湖（Feki-Sahnoun等，2017年；Feki-Sahnoun等，2020年），那么建立高頻率監(jiān)測可能會更加有效。2. 在大尺度（每周取樣）上調(diào)查的赤潮與環(huán)境變量（溫度和鹽度）之間的關(guān)系可能更多地表現(xiàn)為相關(guān)性而不是因果關(guān)系，而在更短時間尺度（1小時）上進(jìn)行高分辨率觀察可能更能凸顯環(huán)境變量和Karenia selliformis赤潮之間的因果關(guān)系。3. 在物種組成方面，Karenia selliformis的暴發(fā)在生長期和穩(wěn)定期的最初幾天幾乎是單一物種，但在暴發(fā)衰退期間則趨于多樣化。自動圖像分類機(jī)制在提供微型浮游植物組成中各物種相對貢獻(xiàn)的準(zhǔn)確估計方面會更加有用（Campbell等人，2010）。Feki-Sahnoun等人（2020）使用樸素貝葉斯分類器模型框架分析了Karenia selliformis暴發(fā)期間和之后的物種組成，得出了不同的結(jié)論，顯示Karenia selliformis在暴發(fā)期間與一些裸藻和甲藻相關(guān)。這種差異可能源于所涉及調(diào)查的時間尺度不同。在每周監(jiān)測中被認(rèn)為是暴發(fā)的現(xiàn)象在高頻率調(diào)查中可能對應(yīng)于暴發(fā)結(jié)束，因此可能反映出類似的多種物種組成，而暴發(fā)在其開始時是單一物種的。4. Karenia selliformis的生長速率和產(chǎn)量對生物量積累的影響。Karenia selliformis像大多數(shù)甲藻一樣，復(fù)制非常緩慢，每天的分裂少于1次（Brand等，2012）。在暴發(fā)期間測得的生長速率證實了這一說法，在暴發(fā)生長期和穩(wěn)定期內(nèi)，每天的分裂次數(shù)幾乎不到一次（<0.69 d?1），第6天的分裂次數(shù)超過一次，暴發(fā)結(jié)束時接近每天一次分裂（圖8）。問題在于Karenia selliformis如何在相對較低的生長速率下實現(xiàn)這種生物量積累。有人可能會質(zhì)疑基于最大和最小平均生物體積比率的生長速率估計。這種簡單的方法假設(shè)細(xì)胞的生長和分裂是分時進(jìn)行的（同步群體），而實際上這些過程在群體中是同時發(fā)生的（Waterbury等，1986；Binder和Chisholm，1995；Jacquet等，2001）。使用Sosik等人（2003）描述的大小結(jié)構(gòu)化種群模型對整個整合期內(nèi)的細(xì)胞生長和分裂進(jìn)行建模，更能代表非同步群體（Dugenne等，2014；Marrec等，2018），并導(dǎo)致高于中位數(shù)尺寸比率的生長速率估計μratio = ln(vmax/vmin)（Marrec等，2018）。在最大生物量期內(nèi)，由于尺寸譜的分解（圖7），生長速率估計受這種限制的影響較小，顯示出在暴發(fā)高峰期的分布相當(dāng)緊湊，這主要受光/暗周期的控制（Ralston等，2007），而在暴發(fā)結(jié)束時尺寸分布更為分散（圖7）。基于流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合圖像處理的浮游植物細(xì)胞尺寸的晝夜變化代表了一種有趣的技術(shù)，用于在高頻調(diào)查期間計算自然浮游植物群體的生長速率。此外，利用這種技術(shù)監(jiān)測有害藻華非常有用，因為它可以識別赤潮物種及其在種群和內(nèi)在水平上的動態(tài)。研究指出，Karenia selliformis的豐度與營養(yǎng)成分之間存在高度相關(guān)性，暴發(fā)生長期可能受到磷（P）的限制，暴發(fā)結(jié)束時則可能受到氮（N）的限制。由于生態(tài)系統(tǒng)中特別富含有機(jī)物質(zhì)和異養(yǎng)原核生物，Karenia selliformis的混合營養(yǎng)行為也不能被排除。在監(jiān)測的最初幾天，Karenia selliformis幾乎表現(xiàn)為單一物種的暴發(fā)。計算的生長速率總體顯示較低值（<1次分裂/天），因此不足以解釋積累的生物量。潮汐動態(tài)似乎在爆發(fā)濃度中起到了主要作用。確定物理運(yùn)輸和凈生長對某一地區(qū)物種積累的貢獻(xiàn)是值得研究的。如您需要了解更多信息，請識別下方二維碼填寫登記表，我們會為您提供專業(yè)的服務(wù)，真誠期待與您的合作！
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