細胞活力的測定在生命科學和生物技術的許多領域都是必不可少的環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)上，細胞活力通常通過寬視野光學顯微照片中染色細胞的半自動或自動計數(shù)來確定，通常這種檢測方法需要額外的染色標記過程，故很難作為在線或原位快速檢測的手段。Ampha Z32微流控阻抗流式細胞儀（IFC）是一種基于Coulter原理的無需標記的單細胞檢測技術，可在線快速、準確測定懸浮液中單細胞的活性狀態(tài)。Ampha Z32不含光學元件，無需調(diào)整和校準，便于攜帶，不僅可在實驗室使用，還同樣適用于實驗室外的檢測。此前，Ampha Z32多用于花粉質(zhì)量分析，但目前其也逐步應用到細胞生物學的許多領域，如檢測癌細胞的活力、分化和凋亡（Ampha Z32阻抗流式細胞儀在癌細胞狀態(tài)鑒定中的應用）；監(jiān)測牛紅細胞寄生蟲感染過程；成纖維細胞分化為脂肪細胞的研究；甚至是納米材料毒性評估（Ampha Z32阻抗流式細胞儀在納米材料毒性篩選中的應用）等方面。本文利用Ampha Z32精確并快速的評估了正常和熱滅活、發(fā)酵過程中以及長期好氧間歇培養(yǎng)過程中酵母細胞的細胞活力和細胞狀態(tài)，并與常規(guī)染色方法進行了比較。此外，還監(jiān)測了感染桿狀病毒后昆蟲細胞活性的變化并預測了胞內(nèi)蛋白的理想收獲時間。
圖1 IFC法與PI熒光染色法測定的酵母活性的相關性A）10MHz頻率下釀酒酵母（Scc ATCC 9080）活細胞（未處理；綠點）和死細胞（熱處理；紅點）的IFC相位角（x軸）-振幅（y軸）疊加散點圖；B）IFC法（n=3，std=0.15%）和染色法（n=3，std=4.4%）的相關性分析（R2=0.996）IFC法：本實驗中未經(jīng)處理和熱處理的酵母死細胞樣品按預定比例（1:0、3:1、1:1、1:3、0:1）混合至100μl，之后用AF6緩沖液進一步稀釋至2ml，經(jīng)20μm過濾器過濾后上機測試，三次重復，細胞采集數(shù)目設定為20000。PI法：200μl AF6和100μl 3.0μg/ml碘化丙啶（PI）稀釋100μl上述未經(jīng)處理/熱處理的細胞混合物，并使用熒光顯微鏡（Leica）計數(shù)PI染色（死亡）和未染色（存活）細胞。實驗結(jié)果表明，相較于傳統(tǒng)染色鏡檢法，Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC）操作簡單、測量快速，是一種統(tǒng)計性、重復性、測量精度以及標準化程度都更高的檢測方法。常規(guī)培養(yǎng)下和兩性霉素B（Sigma）處理后釀酒酵母活性的變化
圖2 常規(guī)培養(yǎng)下釀酒酵母（Scc ATCC9080）活性的變化（IFC法）
圖3. 常規(guī)培養(yǎng)下和兩性霉素B（Sigma）處理后釀酒酵母活性的變化A）常規(guī)培養(yǎng)下，釀酒酵母（Scc ATCC 9080）活性相位直方圖隨時間的變化（10 MHz）。C）在添加1μg/ml的兩性霉素B后的0-5h內(nèi)，釀酒酵母（Scc ATCC 9080）活性相位直方圖的變化釀酒酵母（Scc ATCC 9080）常規(guī)培養(yǎng)，即250 ml錐形瓶中在28°C的搖動培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天，培養(yǎng)基為100 ml YPD。兩性霉素B（Sigma）處理，即將常規(guī)培養(yǎng)中處于指數(shù)生長時期的釀酒酵母細胞暴露于1μg/ml的兩性霉素B中。圖2為接種培養(yǎng)后的第1、7和14天，釀酒酵母的相位-振幅散點圖的變化，從圖中可以看出，在接種培養(yǎng)的第7天出現(xiàn)兩個明顯可區(qū)分的類群。在培養(yǎng)的18天中，可以清晰看到活性酵母類群的逐漸向低相位和較小振幅移動（圖3A），也就是說，隨著培養(yǎng)時間的延長，酵母細胞活性逐漸下降（圖3B）。此過程反映了在長期好氧間歇培養(yǎng)中，因營養(yǎng)限制而導致的酵母細胞的死亡過程。圖3C同樣觀察到經(jīng)兩性霉素B（Sigma）處理后，釀酒酵母細胞的活性逐漸降低，但這一過程反映的是毒性化合物誘導下酵母細胞的死亡過程。這表明IFC還可應用于懸浮細胞的無標記毒理學研究，例如用于IC50值的測定。
A） 開始發(fā)酵后的前3天，酵母細胞的相位-振幅散點圖變化。B） 發(fā)酵過程中的酵母細胞的密度（黑色）、活力（橙色）和乙醇濃度（藍色）隨時間的變化。啤酒釀造發(fā)酵罐中的生長條件與前面討論的情況不同，圖4記錄了酵母的發(fā)酵過程，開始的第1天（紅色）到第2天（綠色），酵母細胞呈指數(shù)增殖，細胞濃度從5.4增加到25.3 x 106細胞/ml，細胞活力從57.1增加到83.9%（圖4B）。第3天結(jié)束時，酵母細胞（藍色）移向較低的相角，這意味著細胞濃度的增長減慢，細胞活力下降。而發(fā)酵罐中乙醇濃度從第一天的0.1%迅速增加到第三天的3.1%（圖4B）。這是由于培養(yǎng)第一天細胞濃度低、活力低且發(fā)酵罐中仍存在大量氧氣，當發(fā)酵罐中的氧氣全部消耗完后，酵母轉(zhuǎn)入?yún)捬跻掖及l(fā)酵，乙醇濃度迅速增加，而乙醇濃度增加又會對酵母細胞產(chǎn)生毒性，故酵母細胞活性降低。IFC的檢測到的活性相位變化與以上響應過程高度一致。本文利用Ampha Z32（IFC）分別跟蹤了感染和未感染染桿狀病毒（BV）的Sf9昆蟲細胞培養(yǎng)物在首次傳代后的99h內(nèi)的活力變化。
圖5 感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲細胞活性的變化
圖S4 感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲細胞活性相位疊加圖上圖為Sf9昆蟲細胞在感染桿狀病毒后的數(shù)小時（hpi）內(nèi)，相位-振幅散點圖的變化（0hpi為感染前的參考培養(yǎng)物）。在BV感染從0到99 hpi的整個過程中，相位-振幅散點圖的可明顯分離出三個細胞類群，分為是活細胞（viable）、感染晚期（LPI）和死細胞（dead）類群（圖5）。類似于酵母（圖1），在較高的相位值（150?到220?）下分離出“活”細胞類群。這部分活細胞在感染后的0-48hpi，阻抗振幅增加了約60%，這與感染后細胞的“膨脹”狀態(tài)相一致。阻抗振幅的變化提供了感染水平的定量讀數(shù)，可用于從病毒滴定分析中確定病毒與細胞比率（感染多重性，MOI）。48hpi后，活細胞的阻抗振幅降低（細胞萎縮）且數(shù)量逐漸減少，直至99hpi細胞全部死亡（見圖6）。感染晚期（LPI）細胞類群出現(xiàn)在較低相位，這部分細胞在0-60hpi逐漸增加隨后減少直至消失，這是由于感染后期的細胞裂解所致。
圖S3 未感染桿狀病毒（BV）的Sf9昆蟲細胞活性的變化上圖為未感染桿狀病毒（BV）的Sf9昆蟲細胞活性的變化，同感染細胞一致，相位-振幅散點圖也可分離出活細胞（viable）、感染晚期（LPI）和死細胞（dead）類群。如圖所示，細胞活力(97.9 %±0.7 %)在79 hpi的連續(xù)生長過程中始終保持不變。僅當在99 hpi超過典型的繼代間隔時間時，細胞活力下降至約93.1%，這可能是由于營養(yǎng)限制或細胞密度過高所致。與感染的Sf9昆蟲細胞的相位-振幅散點圖（圖5）相比，未感染細胞的振幅分布（與細胞大小相關）在0-60h內(nèi)略有變窄，而直到60h才明顯檢測到LPI（感染晚期）細胞類群，到99h時該類群略有增加。感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲細胞活力和重組蛋白表達的時間動力學變化本文除利用IFC法、臺盼藍染色鏡檢法追蹤了感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲細胞活性的動力學變化，還同時利用綠色熒光蛋轉(zhuǎn)染Sf9細胞以量化重組蛋白的產(chǎn)量，下圖為感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲細胞活力和重組蛋白表達的時間動力學變化。
圖6 感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲細胞活力和重組蛋白表達的時間動力學變化結(jié)果表明，在感染BV后的24hpi內(nèi)，IFC法與臺盼藍成像細胞計數(shù)器的檢測結(jié)果高度一致；24-60hpi內(nèi)，IFC法檢測到的活性快速下降到50%（紅實線），而臺盼藍成像細胞計數(shù)器檢測到的細胞活性下降緩慢，僅從100%下降到80%（藍實線）；從60hpi后，細胞活性均快速下降，但到99hpi時，IFC法的檢測結(jié)果僅為5%，而臺盼藍成像細胞計數(shù)器的檢測結(jié)果為42%；整個測試過程中，兩者差異在79hpi時達到最大，分別為11%和78%。79hpi的相位-振幅散點圖（圖5）表明此時IFC法可以準確捕捉到細胞阻抗信號發(fā)生了巨大變化（細胞的大規(guī)模重組），而臺盼藍成像細胞計數(shù)器卻不能及時檢測到這一變化。在BV感染的不同階段，細胞大小有顯著差異。因此，臺盼藍成像細胞計數(shù)法通常用細胞大小表征BV感染的狀態(tài)和重組蛋白的產(chǎn)量質(zhì)量。如圖7所示，在23-60 hpi之間，感染細胞從最初的12.8μm膨脹到約16μm，然后在99 hpi時最終縮減到8.5μm（圖7A，紅色虛線）。這與IFC法獲得的平均振幅（圖7A，黑色虛線）的變化趨勢非常相似，分析表明，振幅數(shù)據(jù)與平均細胞大小有很好的相關性（R2=0.901）（圖7B）。也就是說IFC法不僅可以評估細胞的活力，還可以評估細胞的大小。
圖7 感染桿狀病毒（BV）后的Sf9昆蟲細胞大小的變化LPI（感染晚期）類群大小與重組蛋白產(chǎn)量的關系相較于臺盼藍成像細胞計數(shù)法，IFC法可進一步將失活細胞區(qū)分為感染晚期（LPI）和死細胞（dead）兩個類群（圖5）。隨感染時間的延長，LPI類群的細胞在48-60 hpi內(nèi)逐漸增多，到72 hpi幾乎全部消失。這一類群的大小與裂解細胞中檢測到的表達trGFPuv的濃度相關（圖6，紅色虛線和黑色實線）。隨著BV感染的進一步發(fā)展，表達的trGFPuv隨細胞裂解釋放到培養(yǎng)基中（圖6，黑色虛線），其濃度的變化與IFC確定的死亡細胞總數(shù)的比例完全一致（圖6，紅色虛線）。盡管細胞外表達的trGFPuv的數(shù)量最終會超過細胞內(nèi)的trGFPuv，但培養(yǎng)基中的不必要反應和裂解細胞釋放的蛋白酶可能會降低表達蛋白的質(zhì)量，因此研究者并不希望將這部分釋放的蛋白質(zhì)用于后續(xù)應用。由于IFC法檢測到的LPI群體與表達的胞內(nèi)蛋白密切相關，因此利用Ampha Z32（IFC）可以很好地預測胞內(nèi)蛋白的理想收獲時間。以上研究表明，Ampha Z32（IFC）微流控阻抗流式細胞儀是一種快速、可靠、無標記的細胞活力檢測技術。不僅可以在發(fā)酵過程中可靠測定細胞活力，細胞大小的變化，評估培養(yǎng)條件；還可以在昆蟲細胞bv感染過程中篩選理想的表達條件、病毒滴度，預測BV昆蟲細胞系統(tǒng)中獲得胞內(nèi)蛋白的理想時間，可廣泛應用于微生物和動物單細胞的培養(yǎng)中。
