最近幾年，基于對綠藻和藍細菌的一些測量結果，打破了我們長期認為的光合生物體內(nèi)可變熒光完全來自光系統(tǒng)II的認知范式。通過比較光誘導的Fv＞700 nm和Fv＜710 nm的變化可以用來鑒定Fv(I)。強光誘導的Fv(I)在Fv＞700 nm時比在Fv＜710 nm時約大1.5倍。近期Ulrich Schreiber教授發(fā)表在Photosynthesis Research上的新研究成果以模式綠藻小球藻(Chlorella vulgaris)為研究對象，通過比較遠紅光(720 nm，大部分被PSI吸收)和可見光(540 nm，被PSI和PSII吸收)激發(fā)的光誘導長波熒光(＞765 nm)變化，進一步擴展了該方面的工作。該研究測量了由540 nm飽和光引起的可變熒光(Fv)多相上升曲線，將初始O-I1上升相歸一化后，假定反映Fv(II)，結果顯示出720 nm激發(fā)(720 ex)的 I2-P瞬態(tài)比540 nm激發(fā)(540 ex)的高2倍的。分析Fo(I)對Fo(720 ex)和Fo(540 ex)的貢獻發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)o(I)720 ex比Fo(I)540 ex高2倍，這支持了整個I2-P瞬變是由Fv(I)引起的觀點。F(I)/F(II)的激發(fā)比從 680 nm 到 720 nm 的兩倍增加遠小于作用光譜已知的PSI/PSII 的八到十倍增加。有人認為，測得的F＞765 nm并不代表PSI的大部分葉綠素，而是反映了一小部分具有吸收遠紅光特性的葉綠素形式(“red Chls”)。另外，基于相同的方法，即比較用720 ex和540 ex測量的多相上升曲線，F(xiàn)v(I)也被證實普遍存在于其他各種光合生物中，如藍細菌、苔蘚、蕨類植物、高等植物葉片。
上述研究結果是由德國伍茲堡大學教授Ulrich Schreiber使用多激發(fā)波長調(diào)制葉綠素熒光儀Multi-Color-PAM和雙通道葉綠素熒光儀DUAL-PAM-100組合的測量系統(tǒng)做出的。文章于2023年1月4日發(fā)表在光合作用專業(yè)期刊Photosynthesis Research上，標題為“Light-induced changes of far-red excited chlorophyll fluorescence: further evidence for variable fluorescence of photosystem I in vivo”。在本研究中Multi-Color-PAM充分發(fā)揮了它出色靈敏度與卓越時間分辨率(10 μs)相結合的特點，同時它還具有多個波長的激發(fā)光，非常適合于研究光系統(tǒng)捕光天線尺寸，反應中心關閉和開放，以及類胡蘿卜素自由基參與進行的快速高光強淬滅(HIQ)。
2021年初Ulrich Schreiber教授曾在Photosynthesis Research上發(fā)表過一篇題為Evidence for variable chlorophyll fluorescence of photosystem I in vivo的文章。研究了綠色單細胞藻類小球藻、藍藻聚球藻和淡綠色常春藤葉片，呈現(xiàn)的結果為體內(nèi)存在可變PS I熒光Fv(I)提供了強有力的證據(jù)。這次通過測量遠紅光激發(fā)誘導葉綠素熒光的變化無疑為活體內(nèi)存在光系統(tǒng)I可變熒光進一步提供了新的證據(jù)。(往期推文：科學家發(fā)現(xiàn)活體中光系統(tǒng)I存在可變?nèi)~綠素熒光的證據(jù))
使用遠紅光(FR，優(yōu)選720 nm)或可見光(優(yōu)選540 nm)脈沖調(diào)制激發(fā)檢測單元比較測量光誘導葉綠素熒光產(chǎn)量變化的實驗裝置框架圖。光學單元的幾何形狀針對兩種類型的測量光(ML)以及540 nm光化光(AL)和多周轉閃光 (MT)的均勻照明進行了優(yōu)化。脈沖調(diào)制熒光的相對產(chǎn)率是用由PamWin-3軟件控制的Multi-Color-PAM熒光儀測量的。定制的540 nm LED陣列由DUAL-PAM-100的控制單元(DUAL-C)供電，并通過從MC-PAM獲得的預編程觸發(fā)信號進行控制。
使用720 nm(紅線，720ex)和540 nm(藍線，540ex)脈沖調(diào)制測量光測量暗適應的小球藻懸浮液得到的多相熒光上升曲線。熒光從I1-P的相變，720ex大于540ex。在MT誘導過程中，兩個信號之間的差異在2 ms內(nèi)保持在675 mV，然后在上升到P點期間增加到755 mV。由于720ex的PSI/PSII激發(fā)比毋庸置疑的高于540ex，這意味著上升P點的部分熒光必須來自PSI，因此反映了Fv(I)。
使用720 nm脈沖調(diào)制激發(fā)測量的多相熒光上升曲線，將Fo反卷積為Fo(I)和Fo(II)的貢獻。Fo(540ex)由35%Fo(I)和65%Fo(II)組成，F(xiàn)o(720ex)由52%Fo(I)和48%Fo(II)組成。540ex的Fo(I)/Fo(II) = 35/65 = 0.539，而720ex的為52/48 = 1.083。因此，720ex的Fo(I)/Fo(II)比率恰好比540ex大2倍。因此，F(xiàn)v(I)/Fv(II)的比率也應比720ex比540ex高2倍。
暗適應后(PQ庫部分還原)小球藻全部Fv(720ex)多相上升動力學的Fv(I)和Fv(II)組分的反卷積。
在弱FR背景光(PQ庫預氧化)存在下，全部Fv(720ex)動力學的Fv(I)和Fv(II)分量的反卷積。
小球藻540ex和680ex(圖a)，700ex(圖b)，720ex(圖c)的多相上升動力學。680 nm以上的激發(fā)波長下顯示出“額外的Fv(I)”。
小球藻中“額外Fv(I)”的信息源自使用540ex 和紅光-光紅光光譜范圍內(nèi)的各種激發(fā)波長對多相上升動力學的比較測量。a: “額外Fv(I)”的動力學。b “額外Fv(I)”的振幅與紅光-光紅光激發(fā)波長的函數(shù)。“額外的Fv(I)”被縮放為O-I1振幅的分數(shù)。
使用720ex(紅線)和540ex(綠線)測量的 3 種不同強度的540 nm光化照明開始時的暗-光熒光誘導動力學曲線探究Fv(I)對光化強度的依賴性。
0.1 μM DCMU(a)和1 μM DCMU(b)對用720ex和540ex測量的多相上升動力學曲線的影響。
不同光合生物各自720ex和540ex 測量的Fv值之間的差異。這些結果只是為了證明光合生物中“額外Fv(I)”現(xiàn)象的普遍性。截至目前，強光化光引起熒光產(chǎn)率的多相上升動力學幾乎完全根據(jù)Fv(II)來解釋。雖然人們普遍認為“光化學”O(jiān)-I1(或O-J)相反映了PSII反應中心關閉時的Fv(II)，但“熱”I1-I2-P(或J-I-P)相對此則給出了完全不同的解釋。隨著研究人員的新證據(jù)證明I2-P相反映了小球藻中的Fv(I)，我們必須重新考慮以前對多相上升動力學這部分的解釋。至于前面的I1-I2階段，新的文章以及Schreiber和Klughammer 2021的文章中提供的數(shù)據(jù)清楚地表明它反映了Fv(II)，這就提出了I1相對于I2 的淬火性質問題。文獻中討論了涉及PSⅡ受體和供體側、氧化的PQ以及PSII 反應中心水平的“構象”變化的許多機制。一個關鍵觀察結果是DCMU消除了這種猝滅。支持Schansker 等人的早期結論?；?PSII 構象變化的淬火機制受到Magyar 等人的青睞。他們基于的結果是在DCMU存在的情況下對閃光引起的熒光上升的測量。在這些研究中，在飽和的1.5 μs閃光后達到中間熒光產(chǎn)率 F1，并且只有大量這樣的閃光才能達到最大熒光產(chǎn)率 Fm。從 F1 到 Fm 的轉變被認為反映了光化學誘導的蛋白質構象變化，這種變化在體內(nèi)“對大部分Fv 負責”。鑒于本研究的結果，這種 Fv 對從 Fo 到 Fm(或 P)的整體增加的貢獻似乎僅適用于 I1-I2階段。然而，這不僅可以通過 DCMU 消除，而且還可以通過在黑暗中預還原 PQ 池來很大程度上抑制。前面得一幅圖中，P、I1和“額外Fv(I)”的振幅分別為1.63、1.00 和 0.31。假設在小球藻中 Fv(I) = 2ד額外的 Fv(I)”幾乎沒有 I1-I2可能與 Fv 由于光驅動的構象變化有關。然而，不能排除當PQ庫在黑暗中還原時會引起構象變化。任何進一步嘗試回答I1和 I1-I2相淬火的起源都超出了本通訊的范圍。在實際應用中，飽和脈沖猝滅分析具有特殊的價值，因為它可以評估樣品在給定光照狀態(tài)下的光合狀態(tài)。在這些條件下，F(xiàn)d下游的反應被光激活，F(xiàn)v(I)的干擾被最小化。然而，當在暗適應后測量最大Fv/Fm時，需要特別注意，其中Fv和Fm的值包含大量的I2-P分量，因此也包含大量的Fv(I)。這個問題可以通過適應低強度背景照明來代替嚴格的暗適應來避免。預光照應激活 Fd下游的反應，而不會引起顯著的能量依賴性非光化學猝滅NPQ。由此產(chǎn)生的 I2-P抑制不可避免地導致較低的Fv/Fm值。另一方面，當修正F(I)對Fo的貢獻時，會獲得更高的Fv/Fm值。當忽略Fv(I)的存在時，這可能會導致對光誘導熒光變化的誤解。例如，非光化學猝滅(NPQ)通常參考暗適應后測量的 Fm 狀態(tài)進行量化。當在中等光強度下照射時，最大熒光產(chǎn)量Fm'相對于Fm下降，這正式導致NPQ增加，而實際上Fm'的下降是由于光激活抑制I2-P相 PSI下游的反應。在NPQ的定量研究中應考慮到這一方面，方法是將暗適應后的 I2水平而不是Fm水平作為參考。為什么Fv(I)沒有更早被發(fā)現(xiàn)？90多年前，當Hans Kautsky發(fā)現(xiàn)可變Chl熒光時，當時還沒有關于存在兩個光系統(tǒng)的信息。此類信息在30年后逐漸出現(xiàn)，Chl熒光被證明是闡明PSII中水的分裂與PSI受體側NADP還原之間的各種電子傳輸步驟的先驅工具。雖然很明顯部分熒光源自PSI，但人們認為這是恒定的，僅對暗熒光Fo 有貢獻。我們現(xiàn)在知道，與Fv(II)相比，F(xiàn)v(I)的振幅確實很小。此外，F(xiàn)v(I) 僅在相對較短的時間窗口(20到200毫秒)內(nèi)用飽和光照射時瞬態(tài)發(fā)展。最后但同樣重要的是，F(xiàn)v(I)在連續(xù)光照和DCMU 存在下被抑制。雖然DCMU通過阻斷二次電子傳輸在PSII初級反應的研究中非常有價值，但PSI不存在類似的抑制劑。據(jù)推測，這是迄今為止Fv(I)尚未被強大的時間分辨熒光測量技術檢測到的主要原因，在過去的30年中，該技術已應用于許多研究兩個光系統(tǒng)吸收的激發(fā)能的命運 。原理上，衰變相關光譜(DAS)允許對體內(nèi)Chl熒光的特性進行詳細和準確的分析。PSI和PSII熒光的貢獻可以很容易地根據(jù)它們截然不同的壽命和衰變相關的激發(fā)和發(fā)射光譜來區(qū)分。然而，當作為檢測Fv(II)的常規(guī)做法添加PSII抑制劑DCMU時，F(xiàn)v(I)被有效阻止。當PSI下游的反應被預光照光激活時，F(xiàn)v(I)的誘導也會被阻止。暗適應后，必須應用非常強的多次周轉光脈沖以確保 PSI(鐵氧還蛋白)受體側的限制關閉，然后通過光激活再次打開，這在藻類和藍藻中特別快。另一方面，由于可以預期Fv(I) 的壽命比 Fo(I) 的壽命長得多，并且相對于Fv(II) 應該有相當大的紅移，因此可以通過時間確認其存在。當滿足上述要求時，分辨測量應該不會太困難。1、Multi-Color- PAM 熒光儀被擴展用于使用 FR 脈沖調(diào)制測量光測量暗光 Chl 熒光誘導動力學。2、使用該測量系統(tǒng)，首次在波長> 765 nm處測量了PSI熒光激發(fā)F(I)的多相上升動力學。3、對原始720ex 信號中包含的相對較大的恒定背景信號進行量化和校正，因此不僅可以獲取有關Fv(I) 的定量信息，還可以獲得有關 Fo(I) 的定量信息。4、按照 Schreiber 和Klughammer (2021) 介紹的方法，重新調(diào)整 720ex 和540ex 響應，使其 O-I1振幅相等，因此所有F(II) 響應均等。5、從O-I1均衡Fv(720ex)和Fv(540ex) 響應之間的差異，推導出選擇性Fv(I)響應，對應于720ex 與 540ex相比觀察到的“額外Fv(I)”。6、分析Fo(I)和Fo(II)對Fo(720ex)和Fo(540ex)的貢獻表明，在暗適應的小球藻中，720ex的Fo(I)/Fo(II)比值比540ex高兩倍，假設Fo(I)/Fo(II) = 35/65與540ex 的合理比率。7、假設Fv(I)/Fv(II)與720ex的比率超過540ex的2倍，推斷在暗適應的小球藻中，F(xiàn)v(720ex)中包含的Fv(I)總計2倍“額外的Fv(I)”。8、基于此Fv(I)信息，對Fv(II)動力學進行了解卷積，它與原始Fv(720ex)動力學非常匹配，直至約20 ms，F(xiàn)v(I) 開始發(fā)展。此后，F(xiàn)v(II)開始飽和，而Fv(I)在約200 ms時顯示瞬態(tài)峰值。數(shù)據(jù)支持 I2-P(或 I-P)階段歸因于Fv(I) 的觀點。9、正如在小球藻中，取決于實驗條件，不能始終區(qū)分不同的 I2階躍或拐點，I2水平被定義為P和I2水平之間的差異等于Fv(I)振幅，即測量的“額外Fv(I)?！?/span>10、在較低光化強度下使用720ex和540ex進行的暗光感應動力學比較測量表明，當無法區(qū)分I1和I2水平時，一些Fv(I) 也隱藏在“經(jīng)典”考茨基效應(O-I-P-S 瞬態(tài))的峰值中。11、發(fā)現(xiàn) DCMU 可以“從上方”抑制I2-P相位，這與最大 F(II) 由I2而不是 P(或 Fm)指示的結論一致。12、使用540ex 和680-740 nm范圍內(nèi)的各種激發(fā)波長的比較測量表明，“額外的 Fv(I)”在波長?> 680 nm 時產(chǎn)生，并在約720 nm 處達到峰值。13、雖然Fv(I)在“紅降”光譜范圍內(nèi)的發(fā)展定性地與眾所周知的PSI/PSII激發(fā)從PSI和PSII 作用光譜中增加一致，但觀察到F(I)/F(II)激發(fā)比率的2倍系數(shù)和有效PSI/PSII 活性的8-10 倍系數(shù)存在明顯差異。提出了“紅色 Chls”在確定在波長?> 765 nm 時測量的F(I) 和 F(II) 特性中的可能作用。14、重新審視了Schreiber 和 Klughammer (2021)中的F > 700與F < 710數(shù)據(jù)，其中F < 710 響應中相對較大的I2-P振幅似乎反映了“太多”F(I) < 710。精細分析 這些數(shù)據(jù)顯示Fo(I) > 700/Fo(I) < 710 = Fv(I)?> 700/Fv(I) < 710 = 1.48，當激發(fā)比F(I)/F(II) = 假設F < 710 為 35/65。得出結論，活體內(nèi)F < 710確實包含比通常假設更多的F(I)，這與過去10年許多實驗室發(fā)表的報告一致，即LHCII是PSI天線系統(tǒng)的組成部分。15、使用 720ex 和540ex 對各種不同的光合生物進行的比較測量表明，所有這些生物中都有大量“額外的Fv(I)”。在藍藻中發(fā)現(xiàn)了一個特別大的“額外 Fv(I)”(幾乎與 O-I1相一樣大)，因此似乎特別適合在體內(nèi)進一步研究Fv(I)。—— 參考文獻 ——
1、Schreiber, U. Light-induced changes of far-red excited chlorophyll fluorescence: further evidence for variable fluorescence of photosystem I in vivo. Photosynth Res (2023).
2、Schreiber, U., Klughammer, C. Evidence for variable chlorophyll fluorescence of photosystem I in vivo. Photosynth Res 149, 213–231 (2021).
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