玉米是世界上最重要的作物之一，是重要的糧、經(jīng)、飼兼用作物。玉米小斑病（SLB）、大斑?。∟LB）和莖腐?。‵SR）等病害給玉米產(chǎn)量造成了巨大的損失。鑒定抗性基因和培育具有多種病害抗性（MDR）的遺傳材料是控制病害和減少產(chǎn)量損失的最有效方法。然而，目前已發(fā)現(xiàn)的具有MDR的抗性基因非常有限。已有研究證明使用CRISPR/Cas9工具編輯感病（S）基因（例如Mlo和MDR6）產(chǎn)生的基因組編輯材料是賦予重要經(jīng)濟作物抗病性的有效方法。對于植物抗性育種，挖掘和克隆新的感?。⊿）基因迫在眉睫。
在多種植物中，煙堿酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶1（NANMT1）是煙堿酸轉(zhuǎn)化為葫蘆巴堿（也被稱為N-甲基煙堿酸）的關(guān)鍵酶。山東大學的研究團隊前期的研究發(fā)現(xiàn)，當與NLR (Nucleotide-binding，leucine rich repeat) 蛋白Rp1-D21在煙草系統(tǒng)中瞬時共表達時，玉米ZmNANMT能夠抑制NLR介導的超敏反應（HR）。攜帶雜合體Rp1-D21的玉米品系表現(xiàn)出自激活免疫的表型，包括生長遲緩和無病原菌侵染的HR病點。為了進一步驗證ZmNANMT是否能抑制玉米中Rp1-D21介導的HR，研究團隊前期通過pXG071載體構(gòu)建了ZmNANMT過表達玉米株系。由于DsRed2熒光標記在糊粉層中特異表達，通過眼睛觀察即可區(qū)分陽性和陰性的轉(zhuǎn)基因種子。
近日，山東大學的該研究團隊在以前的研究基礎(chǔ)之上在《Plant Biotechnology Journal》在線發(fā)表了題為“Genome editing of the susceptibility gene ZmNANMT confers multiple disease resistance without agronomic penalty in maize”的研究論文，介紹了研究團隊發(fā)現(xiàn)玉米中一個新的感病基因ZmNANMT，通過基因編輯ZmNANMT提高了玉米對多種病害的廣譜抗性，并且不影響玉米其他重要農(nóng)藝性狀。
研究團隊從15個獨立的轉(zhuǎn)基因株系中，獲得了3個純合基因型的ZmNANMT過表達的T3株系（OE-3、OE-4和OE-11），以及與其對應的陰性同胞株系（Neg-3、Neg-4和Neg-11），其蛋白質(zhì)印跡（western blot）結(jié)果如圖1a所示。研究團隊將OE-3和Neg-3雜交獲得含有雜合Rp1-D21的F1株系，F(xiàn)1植株顯示出Rp1-D21蛋白1:1的分離比，包括OE-3×Rp1-D21、OE-3×no Rp1-D21、Neg-3×Rp1-D21和Neg-3×no Rp1-D21單株。在田間V6生長階段，Neg-3×Rp1-D21植株在第6和第7片葉顯現(xiàn)出非常明顯的HR病斑（圖2a&b）。而與陰性對照相比，OE-3×Rp1-D21植株的HR病斑則表現(xiàn)較弱（圖2a&b）。在抽穗期，OE-3×Rp1-D21的植株明顯高于其陰性對照Neg-3×Rp1-D21植株（圖2c）。這些結(jié)果表明，ZmNANMT在玉米中NLR蛋白Rp1-D21介導的HR中起負調(diào)控作用，且過量表達ZmNANMT可以部分克服Rp1-D21介導的自激活免疫表型。
圖1 過表達株系的蛋白檢測和三個CRISPR/Cas9株系ZmNANMT的序列
為了確定ZmNANMT基因在玉米抗病中的作用，研究團隊鑒定了ZmNANMT過表達株系的玉米主要病害表型，這些病害包括小斑?。⊿LB）、大斑?。∟LB）和莖腐?。‵SR）。結(jié)果顯示，在田間條件下OE-3、OE-4和OE-11植株對SLB、NLB和FSR的感病性高于其對應的野生型同胞植株（圖2d-f）。這表明ZmNANMT是一個玉米多種病害的的感病基因。
圖2 ZmNANMT在玉米防御反應中起著負面作用，對其進行基因組編輯可賦予玉米多種病害抗性且不產(chǎn)生其他農(nóng)藝性狀缺陷
為了探明對ZmNANMT進行基因組編輯能否增強MDR，研究團隊設(shè)計了兩個單鏈向?qū)NA（sgRNA1和sgRNA2），利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)來靶標ZmNANMT（圖1b）。從12個獨立的轉(zhuǎn)基因事件中篩選到3個純合子基因編輯株系：CR-6（sgRNA1和sgRNA2都有1bp的插入）、CR-8（sgRNA1有1 bp插入）和CR-10（sgRNA1附近有31bp的缺失）（圖1b）。所有這三個基因編輯株系都是不含Cas9的，且有預測的開放讀碼框偏移（圖1c）。通過調(diào)查在不同條件下T2或T3植株對不同病害的反應，研究團隊發(fā)現(xiàn)CR株系對FSR、SLB和NLB的抗性分別明顯高于與其對應的野生型同胞株系（圖2g-i）。
圖3 ZmNANMT的過表達植株的農(nóng)藝性狀
為了確定ZmNANMT是否對玉米的主要農(nóng)藝性狀有任何負面影響，研究團隊在田間種植了OE株系和CR株系2年。表型鑒定結(jié)果顯示，OE株系和基因編輯株系在果穗大小和其他農(nóng)藝性狀方面與對應的野生型同胞對照沒有顯著差異(圖2j&k、圖3和圖4）。
圖4 ZmNANMT基因CRISPR/Cas9編輯株系的農(nóng)藝性狀
綜上所述，研究團隊發(fā)現(xiàn)了ZmNANMT是一個新型植物感病基因，通過基因編輯能夠增強玉米對多種病害的廣譜抗性并且不影響玉米的產(chǎn)量。NANMT可以將煙酸轉(zhuǎn)化為葫蘆巴堿，其功能在不同植物物種中是保守的，CR植株的MDR的增加可能是由NA的積累引起的，NA可以增加植物的抗病性。本研究為培育優(yōu)良多抗品種提供了新的基因資源。
—— 參考文獻 ——
Li Y J, Gu J M, Ma S, et al. Genome editing of the susceptibility gene ZmNANMT confers multiple disease resistance without agronomic penalty in maize[J]. Plant Biotechnology Journal, 2023.
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