Ampha Z32花粉活力分析儀的應(yīng)用：評(píng)估大麻花粉的活性和數(shù)量
日期：2022-04-20 18:13:36
大麻（ Cannabis sativa L.），大麻科大麻屬，一年生草本植物，廣泛種植于亞洲、歐洲及南美等國(guó)家和地區(qū)，是我國(guó)傳統(tǒng)的纖維作物，具有重要的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值，被廣泛應(yīng)用于紡織、食品、造紙和建筑等多個(gè)領(lǐng)域。因大麻中的四氫大麻酚（THC）具有致幻成癮的特性，故根據(jù)其含量不同而被區(qū)分為工業(yè)大麻（中國(guó)THC＜0.3%，歐盟＜0.2%，美國(guó)＜0.5%）和毒品大麻。大麻素是大麻中特有的含有烷基和單萜基團(tuán)分子結(jié)構(gòu)的一類次生代謝產(chǎn)物，最主要2種成分是四氫大麻酚( THC) 和大麻二酚( CBD) 。大麻二酚( CBD) 是非精神活性化合物，可以拮抗 THC 與受體的結(jié)合，消除 THC 對(duì)人體產(chǎn)生的致幻作用，除此之外 CBD 具有抗炎、殺菌、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抗氧化等作用，同時(shí)還具有治療精神分裂和阿爾茲海默癥等病癥的潛在醫(yī)療價(jià)值，隨著對(duì)其藥理作用的挖掘，選育高CBD含量低THC水平的藥用大麻品種以已成為全球性的熱點(diǎn)研究。但由于工業(yè)大麻為多為雌雄異株植物，主要是由雌株合成植物大麻素、萜烯和其他次生代謝物，雄株產(chǎn)生花粉，通常大麻素濃度很低，因此藥用大麻的全雌系選育或誘雄制種對(duì)于雌株性狀的保存具有極大的意義，也是目前面臨的一項(xiàng)巨大挑戰(zhàn)。全雌系誘雄過(guò)程中，鑒定花粉的活力和數(shù)量（代表雄配子體的適應(yīng)性）對(duì)于成功授粉至關(guān)重要。德國(guó)霍恩海姆大學(xué)的研究者在本次研究中利用Ampha Z32花粉活力分析儀（阻抗流式細(xì)胞儀，IFC）：● 評(píng)估了兩種富含植物大麻素的大麻基因型KANADA（KAN）和A4的花粉活力（PV）和花粉數(shù)量（TPC）；● 研究了硫代硫酸銀溶液（STS）和赤霉素溶液（GA3）誘導(dǎo)對(duì)兩種大麻基因型PV和TPC的影響；● 研究開(kāi)花天數(shù)（DAF）對(duì)基因型內(nèi)和基因型間PV和TPC的影響。結(jié)果表明，IFC法可準(zhǔn)確測(cè)量大麻的花粉活力并有效估算花粉數(shù)量，是一種高效、可靠、無(wú)標(biāo)記的測(cè)量方法，可進(jìn)一步協(xié)助藥用大麻的育種策略，為大麻植物育種和種植生產(chǎn)開(kāi)辟新的機(jī)會(huì)。—— Ampha Z32花粉活力分析儀簡(jiǎn)介 ——
Ampha Z32花粉活力分析儀（瑞士Amphasys AG）信號(hào)的采集和轉(zhuǎn)導(dǎo)A）細(xì)胞在不同頻率的交流電場(chǎng)中的檢測(cè)結(jié)果，低頻下反映細(xì)胞的體積特性，高頻下反映細(xì)胞膜的介電特性即細(xì)胞活性；B) 微流控芯片；C）流經(jīng)交流電場(chǎng)的細(xì)胞的阻抗信號(hào)（藍(lán)色實(shí)部即電阻信號(hào)，綠色虛部即容性電抗信號(hào)），細(xì)胞膜完整性決定容性電抗的大小，故可通過(guò)虛部信號(hào)來(lái)區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，最終以阻抗相位角-振幅散點(diǎn)圖反映出來(lái)Ampha Z32花粉活力分析儀細(xì)胞儀（瑞士Amphasys AG），通過(guò)檢測(cè)流經(jīng)交流電場(chǎng)的細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞的電阻抗信號(hào)，分析獲得細(xì)胞的數(shù)量、大小、活性。該儀器可以在0.3-30MHz的范圍內(nèi)同時(shí)測(cè)量4個(gè)不同頻率下細(xì)胞的電阻抗特性，適配微流控芯片通道尺寸范圍為15-400μm，可滿足0-300μm范圍內(nèi)的任意生物、非生物單細(xì)胞的活性測(cè)量。已有研究報(bào)道，硫代硫酸銀溶液（STS）和赤霉素溶液（GA3）可通過(guò)與乙烯激素競(jìng)爭(zhēng)誘導(dǎo)全雌系植株雄花形成并開(kāi)花，本實(shí)驗(yàn)研究了KAN和A4兩種基因型大麻經(jīng)這兩種誘雄激素誘導(dǎo)開(kāi)花后的第11、14、18、21和24天（DAF）所收獲的雄花數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有經(jīng)GA3和STS溶液處理的植株都產(chǎn)生了雄花，且植株雄花數(shù)量均隨時(shí)間推移而增加，這表明誘雄激素和開(kāi)花天數(shù)的交互作用對(duì)雄花數(shù)量有顯著影響（表1）。相較于DAF前期，DAF后期雄花數(shù)量的增加更為顯著，其中GA3處理的植株在24DAF的單株雄花數(shù)最高，為220.60；STS處理的植株在24DAF的單株雄花數(shù)最高為273.33（圖1a）。
圖1 在開(kāi)花第11、14、18、21天（DAF）收獲的雄花數(shù)a）赤霉素（GA3）和硫代硫酸銀溶液（STS）處理；b）兩種基因型KAN和A4。此外，基因型和DAF的交互作用同樣顯著影響植株雄花數(shù)量（表1），即基因型KAN和基因型A4的雄花數(shù)量均隨采樣時(shí)間的推移而增加，其中基因型KAN在24DAF產(chǎn)生的雄數(shù)量最高，為189.74；基因型A4在11、21、24DAF的雄花數(shù)量顯著高于基因型KAN，且在24DAF的雄花數(shù)量最多，達(dá)到317.78（圖1b）。表1 每株雄花數(shù)、花粉細(xì)胞總數(shù)（TPC）和花粉活力（PV）的性狀方差分析表
不同誘雄激素下，不同開(kāi)花天數(shù)的花粉細(xì)胞總數(shù)（TPC）如圖2所示，GA3誘導(dǎo)下植株的平均TPC僅為850-1500，而STS誘導(dǎo)下植株的平均TPC在8-14DAF呈上升趨勢(shì)，并在14DAF達(dá)到最高（1.54×105），隨后逐漸下降，在24DAF時(shí)最低（6.67×104），總體而言，STS所誘導(dǎo)植株產(chǎn)生的TPC大約是GA3誘導(dǎo)下的100倍，可見(jiàn)兩種誘雄激素下的平均TPC存在顯著差異，但兩個(gè)基因型間的平均TPC并未發(fā)現(xiàn)顯著差異（表1）。
圖2 赤霉素（GA3）和硫代硫酸銀（STS）誘導(dǎo)開(kāi)花后的不同天數(shù)產(chǎn)生的平均花粉細(xì)胞總數(shù)（TPC）花粉數(shù)量可能是提高雜交種子產(chǎn)量的關(guān)鍵性狀之一，但在以往確定雌株大麻誘雄效率的研究中，卻并未考慮花粉數(shù)量。在本次研究的采樣期間內(nèi)，兩種誘雄激素處理下的兩種基因型的雄花數(shù)量差異均不顯著，但TPC差異顯著，STS處理產(chǎn)生的花粉細(xì)胞數(shù)量明顯高于GA3。因此在大麻育種過(guò)程中，通過(guò)STS可誘導(dǎo)雄花并產(chǎn)生足夠數(shù)量的花粉供授粉，可有效減少雄株的種植比例，且從花粉數(shù)量推斷14-18DAF可能是理想的采粉窗口期。不同誘雄激素下，不同開(kāi)花天數(shù)的花粉活力（PV）如表1所示，基因型、誘雄激素類型以及開(kāi)花天數(shù)（DAF）的交互作用顯著影響花粉活性（PV）。相較于STS處理，兩種基因型在GA3處理下的PV在所有DAF內(nèi)都較低，但差異大小各不相同。STS處理下，基因型A4在18DAF的PV最大（79.36%），但與14 (77.88%)、21 (71.33%) 和 24 (51.92%) DAF的PV無(wú)顯著差異，8(45.66%)和11(53.86%)DFA的PV較低（圖3a）；而基因型KAN在11DAF的PV最大（78.18%），與8 (71.23%)、14 (77.22%)、18 (67.20%) 和 21 (70.43%) DAF的PV沒(méi)有顯著差異，但24 (36.49%)DAF的PV明顯下降。GA3處理下，基因型A4的PV在11（34.90%）DAF最高，24 (14.88%) DAF最低；而基因型KAN的PV在14（24.24%）DAF最高，8DAF最低，僅為0.63%（圖3b）。
圖3 基因型（a）A4和（b）KAN在GA3和STS處理下的花粉活性力（%）花粉活力對(duì)溫度和濕度極其敏感，IFC法可在收獲花粉后立即測(cè)量花粉活力，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于環(huán)境壓力所導(dǎo)致的花粉活力受損，可有效指導(dǎo)花粉收獲的最佳時(shí)間。本次研究結(jié)果表明，8-24DAF為大麻花粉收獲的窗口期，利用這17天的窗口期靈活調(diào)整雌花開(kāi)花的同步性，可有效提高大麻育種中的授粉成功率。
